Isolamento e Cultura de Expansão de células endoteliais específicos de tumores
Summary
We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
Abstract
Células específicas do tumor isoladas de fresco endoteliais (TEC) pode ser usada para explorar mecanismos moleculares de angiogénese tumoral e servem como um modelo in vitro para o desenvolvimento de novos inibidores da angiogénese para o cancro. No entanto, a longo prazo expansão in vitro de células endoteliais de murino (CE) é um desafio devido à deriva fenotípica em cultura (transição endotelial-a-mesenquimal) e contaminação com não-CE. Isto é especialmente verdadeiro para o TEC que são prontamente outcompeted por fibroblastos co-purificada ou células de tumor em cultura. Aqui, um método de isolamento de alta fidelidade, que tira vantagem de enriquecimento imunomagnética acoplada com selecção de colónias e expansão in vitro é descrita. Esta abordagem gera frações CE puros que são totalmente livre de contaminação de células do estroma ou tumorais. Também é mostrado que traçou-linhagem Cdh5 CRE: ratinhos repórter / l ZsGreen L / S, utilizada com o protocolo aqui descrito, são uma ferramenta valiosa para verificar a célulapureza como as colônias isoladas CE destes ratos mostram durável e brilhante fluorescência ZsGreen em cultura.
Introduction
Células endoteliais (EC) são essenciais durante o desenvolvimento de tumores sólidos. Do início do interruptor angiogênico em tumores dormentes para divulgação e propagação de metástases em locais distantes, CE constituem as condutas que fornecem sangue, oxigênio e nutrientes para sustentar o crescimento do tumor 1. Como sugerido recentemente, CE também têm funções independentes de perfusão e formar um nicho que suporta o crescimento de células-tronco cancerígenas e outras células do estroma do tumor 2-5. Assim, altamente purificado CE (TEC) para a cultura in vitro específicos do tumor permite estudos funcionais de rotina que irá lançar luz sobre os mecanismos moleculares que medeiam a angiogênese do tumor e conversas cruzadas com células tumorais.
CE são altamente especializados, dependendo do tecido de origem 6. Devido à natureza heterogénea de diferentes tipos de tumores e o microambiente do tumor, TEC também pode exibir características únicas que reflectem uma especialização o específico de tumorf a vasculatura. Por exemplo, existe uma variabilidade notável nas assinaturas de expressão de genes em TEC isoladas de diferentes tipos ou graus de tumores 7,8. No entanto, freqüente co-purificação de não-CE, especialmente fibroblastos associados a tumores e células tumorais, com TEC pode confundir expressão de todo o genoma analisa. Estes tipos de células não desejadas são especialmente problemáticos em estudos que dependem de longo prazo expansão in vitro de culturas TEC.
Aqui descrito é um método de alta fidelidade, que produz consistentemente culturas puras CE de tumores e outros tecidos. Seguindo imunomagn�ica enriquecimento de frações da CE e remoção de co-purificado não-CE coluna, um passo de clonagem-ring adicional para capturar colônias CE puros é usado 9. Cada colônia podem ser expandidas em cultura para várias passagens sem o surgimento de contaminação não-CE. Este método também produz vários clones de CE de um único procedimento de isolamento, o qual é ideal para o estudo de endoheterogeneidade endotelial. Além disso, é mostrado que Cdh5 cre: / l ratos ZsGreen l / s repórter são uma ferramenta valiosa para gerar CE "mapeado-destino" e indelevelmente marcadas que manter ZsGreen fluorescência na cultura 10. Com pequenos ajustes para o protocolo, este método deve ser adaptável a diferentes tipos de tumores ou tecidos normais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido às dificuldades na obtenção de culturas puras TEC primária, muitos estudos in vitro TEC substituto com linhas CE comercialmente disponíveis ou CE primário, como veia umbilical humano CE (HUVEC) 13. No entanto, essas populações da CE a partir de tecidos normais só podem servir como uma proxy para a TEC que diferem marcadamente dos seus homólogos normais. Por exemplo, a TEC são fenotipicamente e funcionalmente anormal in vivo e algumas destas alterações podem ser transmiss?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
| 75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | – | – | |
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
| 15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 6-well tissue culture plates | Corning | – | |
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
| Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
| Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
| Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | – | – | |
| Hemocytometer | – | – | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | – | – | |
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | – | – | |
| Microplate or rotary shaker | – | – | |
| Phase contrast light microscope | – | – |
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