Répandre surface et Immunocoloration des chromosomes de levure
Summary
A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.
Abstract
The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.
Introduction
La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae présente de nombreux avantages pour les études des mécanismes moléculaires des processus biologiques, y compris l'étude des protéines qui contrôlent la fonction de chromosome. Bien qu'il existe des avantages bien connus de la levure bourgeonnante pour les études génétiques, moléculaires et biochimiques, les études cytologiques de la distribution des protéines dans le noyau de la cellule est compliquée par sa petite taille. Le noyau de la levure typique a un diamètre de moins d'un micron, ce qui est seulement d'environ 5 fois la limite de résolution de la lumière visible. Ainsi, la quantité d'informations à propos de la distribution des protéines nucléaires qui peuvent être obtenus à partir de immunocoloration classique ou en utilisant les mots-clés de protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP), est limitée. Une approche utile pour caractériser la répartition des protéines est subnucléaire surface de chromosome se propager. Cette approche consiste à enlever la paroi cellulaire, perturbant les membranes cellulaires et nucléaires, et unllowing le contenu insolubles du noyau de se déposer sur la surface d'une lame de microscope. Ces composants insolubles comprennent la matrice nucléaire et les chromosomes. En plus de permettre l'enlèvement des matières nucléaires solubles, ce qui améliore la capacité de détecter les protéines liées de la chromatine, le chromosome d'étalement méthode conduit à une décompression importante des chromosomes tels que les noyaux de propagation ont des diamètres de l'ordre de 3 à 5 um (pour les noyaux méiotiques diploïdes) et 2 à 3 um pour les noyaux mitotiques diploïdes. Cette décompression permet la détection de sous-structure nucléaire qui est relativement difficile, voire impossible à résoudre dans les noyaux intacts.
Un inconvénient évident de chromosome d'étalement est la possibilité que la procédure d'étalement peut partiellement ou complètement perturber la structure d'intérêt. Il est particulièrement préoccupant que un chromosome lié protéine particulière pourrait être perdu à la suite de la procédure se propager. Cette shou de complication potentielleld être gardé à l'esprit lors de l'interprétation des données. Un exemple d'une protéine qui est sensible à la procédure d'étalement est la bêta-tubuline. Dans certaines conditions, la broche, qui est constitué principalement de la tubuline, est conservée lors de l'épandage 3. Visualisation de la broche est souvent utile de mettre en scène des noyaux d'intérêt. Cependant, la visualisation de la tubuline nécessite un traitement avec un fixateur haute concentration; les broches sont perdus dans les conditions standards décrites ci-dessous. Cet exemple illustre le fait que, lors de l'analyse de la répartition d'une protéine non caractérisée précédemment, il est important de faire varier la concentration de fixateur afin de déterminer la sensibilité de la protéine est d'une telle variation. En dépit de l'inquiétude quant à l'impact des conditions d'épandage sur la structure des chromosomes, l'utilité et la puissance de la méthode de propagation ont été mis en évidence dans de nombreux contextes et a une large utilité dans la caractérisation des mitotique et, en particulier les cellules méiotiques 4-7.
Two méthodes d'épandage ont été largement utilisés. La première de ces méthodes, développées par Dresser et Giroux 8, évite l'utilisation de détergent et peut produire des préparations propagation qui semblent avoir relativement bien conservé la morphologie des chromosomes lors teinté pour le colorant DAPI spécifique d'ADN. Cependant, ce procédé est relativement difficile de mettre au point et à la qualité des noyaux de propagation varie considérablement, quand une zone d'une diapositive est comparée à d'autres régions. Ce problème peut compliquer approches quantitatives qui impliquent l'imagerie de nombreux noyaux non sélectionnés d'une diapositive à éviter que des données biais d'acquisition. La deuxième méthode d'étalement chromosome, développé par Klein et Loidl 1, implique la fixation d'équilibrage par le paraformaldéhyde, avec lyse et la décompression de la chromatine promu par une solution de détergent. Lorsqu'il est correctement effectuée, cette méthode donne des résultats très reproductibles avec moins de variation de région à région par rapport à la méthode Dresser et Giroux. Cette présentation se concentre sur un modifiela version d de la méthode de Loidl et Klein, en raison de sa fiabilité et sa simplicité.
Chromosome propagation est pas compliqué ou de temps; jusqu'à 100 diapositives peuvent être préparés par immunocoloration en une seule journée. En outre, les préparations de propagation peuvent être stockés dans le congélateur pendant des années avant immunocoloration, et donc les laboratoires peuvent développer un référentiel des étalements de chromosomes congelés qui peut être utilisé lorsque de nouvelles questions se posent ou biologiques nouveaux réactifs de coloration deviennent disponibles.
Le procédé d'étalement de chromosomes est le plus couramment utilisé en combinaison avec une immunocoloration et la microscopie à fluorescence à grand champ, mais il est également possible de préparer des lames pour les méthodes microscopiques super-résolution légers tels que l'épuisement de l'émission stimulée (STED) microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.
Materials
| Zymolyase | US Biological | Z1004 | Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use. |
| Lipsol | L.I.P. Ltd | no longer commercially available | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| NP-40 | USB | 19628 | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Slides | Corning | 2948-75×25 | |
| Standard coverslip | Fisher | 12-544-E or 12-540-B | |
| High resolution coverslips | Fisher | 12-542-B | |
| Photo-Flo 200 solution | Kodak | P-7417 | Prepare 0.2% (v/v) solution in water. |
| TBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8 | ||
| BSA | Sigma | A2153 | Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month. |
| Primary antibody | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit | Invitrogen | A-21206 | |
| IgG (H+L) Antibody | |||
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector Laboratories |
H-1200 | |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Plastic slide box | Fisher | 03-448-1 | Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber. |
| Cardboard slide box | Fisher | 12-587-10 | Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C. |
| Coplin jar | Fisher | 08-816 | Use as a wash basin for slides. |
Riferimenti
- Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).
- Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
- Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes. Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).
- Bishop, D. K. RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis. Cell. 79, 1081-1092 (1994).
- Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I. Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).
- Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis. PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).
- Biggins, S., Murray, A. W. The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).
- Dresser, M. E., Giroux, C. N. Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast. The Journal of Cell Biology. , (1988).
- Lao, J. P., Cloud, V., et al. Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation. PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).
- Vonesch, C., Unser, M. A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the. IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).
