भूतल फैल रहा है और खमीर गुणसूत्रों के immunostaining
Summary
A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.
Abstract
The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.
Introduction
नवोदित खमीर के गुणसूत्र समारोह को नियंत्रित करने वाले प्रोटीन का अध्ययन सहित जैविक प्रक्रियाओं के आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए कई लाभ प्रदान करता है। आनुवंशिक आणविक, और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए नवोदित खमीर के जाने-माने लाभ कर रहे हैं हालांकि, सेल के नाभिक में प्रोटीन के वितरण के कोशिकाविज्ञान पढ़ाई अपने छोटे आकार से जटिल है। ठेठ खमीर नाभिक दृश्य प्रकाश के बारे में केवल 5 बार संकल्प सीमा है जो कम से कम एक माइक्रोन, की एक व्यास है। इस प्रकार, पारंपरिक immunostaining से या ऐसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है कि परमाणु प्रोटीन के वितरण के बारे में जानकारी की मात्रा सीमित है। प्रोटीन की subnuclear वितरण निस्र्पक के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण प्रसार गुणसूत्र सतह है। यह दृष्टिकोण, कोशिका दीवार को हटाने सेल और परमाणु झिल्ली, और एक में खलल न डालें शामिलllowing के नाभिक की अघुलनशील सामग्री को एक खुर्दबीन स्लाइड की सतह पर व्यवस्थित करने के लिए। ये अघुलनशील घटक परमाणु मैट्रिक्स और गुणसूत्रों में शामिल हैं। क्रोमेटिन बाध्य प्रोटीन पता लगाने की क्षमता को बढ़ाता है जो घुलनशील परमाणु सामग्री को हटाने की अनुमति के अलावा, इस तरह के प्रसार के नाभिक के चारों ओर 3 माइक्रोन से 5 का व्यास है कि (द्विगुणित meiotic नाभिक के लिए) गुणसूत्रों की पर्याप्त decompression में विधि परिणामों के प्रसार के गुणसूत्र और 2 द्विगुणित mitotic नाभिक के लिए माइक्रोन से 3। इस decompression के बरकरार नाभिक में हल करने के लिए अपेक्षाकृत मुश्किल या असंभव है कि परमाणु बुनियाद का पता लगाने के लिए अनुमति देता है।
प्रसार गुणसूत्र के लिए एक स्पष्ट कमी के प्रसार की प्रक्रिया के हित की संरचना को बाधित आंशिक रूप से या पूरी तरह से हो सकता है कि संभावना है। विशेष चिंता का एक विशेष गुणसूत्र बाध्य प्रोटीन के प्रसार की प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में खो दिया जा सकता है। इस संभावित जटिलता Shouडेटा की व्याख्या जब एलडी ध्यान में रखा जाना। प्रसार की प्रक्रिया के प्रति संवेदनशील है कि एक प्रोटीन का एक उदाहरण बीटा ट्यूबिलिन है। कुछ शर्तों के तहत, मुख्य रूप से ट्यूबिलिन के शामिल है जो धुरी, 3 प्रसार के दौरान संरक्षित है। धुरी के दृश्य अक्सर ब्याज के नाभिक चरण के लिए उपयोगी है। हालांकि, ट्यूबिलिन visualizing एक उच्च एकाग्रता लगानेवाला के साथ उपचार की आवश्यकता है; स्पिंडल नीचे वर्णित मानक शर्तों के तहत खो रहे हैं। यह उदाहरण एक पहले से uncharacterized प्रोटीन के वितरण का विश्लेषण, यह प्रोटीन ऐसी विभिन्नता के लिए कितना संवेदनशील निर्धारित करने के लिए लगानेवाला की एकाग्रता भिन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है, कि दिखाता है। गुणसूत्र संरचना पर प्रसार की स्थितियों के प्रभाव के बारे में चिंता के बावजूद, प्रसार विधि की उपयोगिता और शक्ति कई संदर्भों में प्रदर्शन किया और mitotic के लक्षण वर्णन और, विशेष रूप से meiotic कोशिकाओं 4-7 में व्यापक उपयोगिता है किया गया है।
Twओ प्रसार के तरीकों को बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। ड्रेसर और गिरौक्स 8 द्वारा विकसित की इन विधियों का पहला, डिटर्जेंट के उपयोग से बचा जाता है और डीएनए विशिष्ट डाई DAPI के लिए दाग जब अपेक्षाकृत अच्छी तरह से संरक्षित गुणसूत्र आकृति विज्ञान लग गए हैं कि प्रसार की तैयारी प्राप्ति कर सकते हैं। हालांकि, इस पद्धति सही करने के लिए अपेक्षाकृत मुश्किल है और एक स्लाइड में से एक क्षेत्र अन्य क्षेत्रों की तुलना में है जब फैल नाभिक की गुणवत्ता में नाटकीय रूप से बदलता रहता है। यह समस्या डाटा अधिग्रहण पूर्वाग्रह से बचने के लिए एक स्लाइड से कई अचयनित नाभिक इमेजिंग शामिल है कि मात्रात्मक दृष्टिकोण जटिल हो सकता है। Loidl और क्लेन 1 द्वारा विकसित की विधि प्रसार दूसरा गुणसूत्र, सेल और एक साबुन के घोल से पदोन्नत क्रोमेटिन decompression के साथ, paraformaldehyde के द्वारा निर्धारण संतुलन शामिल है। ठीक से प्रदर्शन करते हैं, तो इस विधि ड्रेसर और गिरौक्स विधि की तुलना में कम क्षेत्र के लिए-क्षेत्र बदलाव के साथ बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देता है। इस प्रस्तुति में एक modifie पर केंद्रितक्योंकि अपनी विश्वसनीयता और सादगी की Loidl और क्लेन की विधि के डी संस्करण,।
क्रोमोजोम प्रसार जटिल या समय लेने वाली नहीं है; अप करने के लिए 100 स्लाइड्स एक ही दिन में immunostaining के लिए तैयार किया जा सकता। इसके अलावा, प्रसार की तैयारी से पहले immunostaining के लिए साल के लिए ठंडे बस्ते में संग्रहित किया जा सकता है, और इस प्रकार प्रयोगशालाओं नई जैविक सवाल उठता है या नई धुंधला अभिकर्मकों उपलब्ध हो जाते हैं जब इस्तेमाल किया जा सकता है कि जमी गुणसूत्र फैलता का भंडार विकसित कर सकते हैं।
गुणसूत्र के प्रसार विधि सबसे आम तौर पर immunostaining और widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में उपयोग किया है, लेकिन यह इस तरह प्रेरित उत्सर्जन कमी (STED) माइक्रोस्कोपी के रूप में सुपर संकल्प प्रकाश सूक्ष्म तरीकों के लिए स्लाइड तैयार करने के लिए भी संभव है।
Protocol
Representative Results
Discussion
The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.
Materials
| Zymolyase | US Biological | Z1004 | Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use. |
| Lipsol | L.I.P. Ltd | no longer commercially available | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| NP-40 | USB | 19628 | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Slides | Corning | 2948-75×25 | |
| Standard coverslip | Fisher | 12-544-E or 12-540-B | |
| High resolution coverslips | Fisher | 12-542-B | |
| Photo-Flo 200 solution | Kodak | P-7417 | Prepare 0.2% (v/v) solution in water. |
| TBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8 | ||
| BSA | Sigma | A2153 | Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month. |
| Primary antibody | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit | Invitrogen | A-21206 | |
| IgG (H+L) Antibody | |||
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector Laboratories |
H-1200 | |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Plastic slide box | Fisher | 03-448-1 | Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber. |
| Cardboard slide box | Fisher | 12-587-10 | Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C. |
| Coplin jar | Fisher | 08-816 | Use as a wash basin for slides. |
Riferimenti
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- Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
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