Summary
A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.
Abstract
The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.
Introduction
Den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae gir mange fordeler for studier av molekylære mekanismer for biologiske prosesser, herunder studiet av proteiner som kontrollerer kromosom funksjon. Selv om det er velkjent fordeler ved spirende gjær for genetiske, molekylære og biokjemiske studier er cytologiske undersøkelser av fordelingen av proteinene i cellens kjerne kompliseres av sin lille størrelse. Den typiske gjær kjernen har en diameter på mindre enn en mikron, som bare er omtrent fem ganger oppløsning grensen av synlig lys på. Således kan mengden av informasjon om fordeling av kjerneproteiner som kan oppnås fra konvensjonell farging eller ved hjelp av fluorescerende protein koder, for eksempel grønt fluorescerende protein (GFP), er begrenset. En nyttig måte å karakterisere subnuclear fordeling av proteiner er kromosom overflatespredning. Denne fremgangsmåten involverer fjerning av celleveggen, forstyrre celle og nukleære membraner, og enllowing de uløselige innholdet i kjernen til å slå seg ned på overflaten til et objektglass. Disse uoppløselige komponenter inkluderer atom matrise og kromosomene. I tillegg til å tillate fjernelse av oppløselige atominnhold, noe som forbedrer evnen til å detektere kromatin bundne proteiner, kromosomet sprer metode fører til betydelig dekompresjon av kromosomer slik at spredningen kjerner har diameter på rundt 3 til 5 mikrometer (for diploide meiotisk kjerner) og 2 til 3 pm for diploide mitotiske kjerner. Dette dekompresjon tillater påvisning av kjernekonstruksjonen som er relativt vanskelig eller umulig å løse i intakte kjerner.
En åpenbar ulempe til kromosom spredning er muligheten for at sprednings prosedyren kan helt eller delvis forstyrre strukturen av interesse. Av spesiell bekymring er at et spesielt kromosom bundet protein kan ha gått tapt som følge av spredning prosedyren. Dette potensialet komplikasjon should holdes i bakhodet når man skal tolke data. Et eksempel på et protein som er følsom for sprednings prosedyren er beta-tubulin. Under noen forhold, spindelen, som består hovedsakelig av tubulin, er bevart under spredning 3. Visualisering av spindelen er ofte nyttig å iscenesette kjerner av interesse. Imidlertid visualisere tubulin krever behandling med en høy konsentrasjon bindemiddel; Spindlene går tapt under de standardbetingelser som er beskrevet nedenfor. Dette eksempel illustrerer at, når analysere fordelingen av en tidligere uncharacterized protein, er det viktig å variere konsentrasjonen av fiksativ for å bestemme hvor følsomt protein er i en slik variasjon. Til tross for bekymring om effekten av spredningsforholdene på kromosom struktur, har nytte og effekt av å spre metoden blitt vist i mange sammenhenger, og har bred anvendelse i karakterisering av mitotisk og, spesielt meiotisk celler 4-7.
Two sprer metoder har blitt brukt mye. Den første av disse metoder, er utviklet av Dresser og Giroux 8, unngår bruk av detergent, og kan gi spredt preparater som synes å ha forholdsvis godt bevarte kromosom morfologi når farget for DNA-spesifikke fargestoff DAPI. Imidlertid er denne fremgangsmåte forholdsvis vanskelig å perfeksjonere og kvaliteten på spredningen kjerner varierer dramatisk når en region av et lysbilde er i forhold til andre områder. Dette problemet kan komplisere kvantitative tilnærminger som involverer bildebehandling mange uselekterte kjerner fra ett lysbilde for å unngå datainnsamling bias. Den andre kromosomet sprer metoden, utviklet av Loidl og Klein 1, innebærer balansering fiksering av paraformaldehyde, med lyse og kromatin dekompresjon fremmet av et rengjøringsmiddel. Når den er riktig utført, gir denne metoden svært reproduserbare resultater med mindre region-til-regionen variasjon i forhold til Dresser og Giroux metode. Denne presentasjonen fokuserer på en Modified versjon av fremgangsmåten ifølge Loidl og Klein, på grunn av dens pålitelighet og enkelhet.
Kromosom spredning er ikke komplisert eller tidkrevende; opp til 100 lysbilder kan fremstilles for farging på en enkelt dag. Videre kan spre forberedelsene oppbevares i fryseren i årene før farging, og dermed laboratorier kan utvikle et oppbevaringssted for frosne kromosom oppslag som kan brukes når nye biologiske oppstår spørsmål eller nye Fargingsreagensmidlene blir tilgjengelige.
Kromosomet spredning metode som er mest vanlig brukt i kombinasjon med immunfarging og fluorescens mikroskopi Widefield, men det er også mulig å fremstille lysbilder for super-oppløsning lette mikroskopiske metoder som stimulert emisjon uttømming (STED) mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.
Materials
| Zymolyase | US Biological | Z1004 | Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use. |
| Lipsol | L.I.P. Ltd | no longer commercially available | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| NP-40 | USB | 19628 | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Slides | Corning | 2948-75×25 | |
| Standard coverslip | Fisher | 12-544-E or 12-540-B | |
| High resolution coverslips | Fisher | 12-542-B | |
| Photo-Flo 200 solution | Kodak | P-7417 | Prepare 0.2% (v/v) solution in water. |
| TBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8 | ||
| BSA | Sigma | A2153 | Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month. |
| Primary antibody | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit | Invitrogen | A-21206 | |
| IgG (H+L) Antibody | |||
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector Laboratories |
H-1200 | |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Plastic slide box | Fisher | 03-448-1 | Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber. |
| Cardboard slide box | Fisher | 12-587-10 | Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C. |
| Coplin jar | Fisher | 08-816 | Use as a wash basin for slides. |
Riferimenti
- Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).
- Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
- Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes. Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).
- Bishop, D. K. RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis. Cell. 79, 1081-1092 (1994).
- Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I. Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).
- Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis. PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).
- Biggins, S., Murray, A. W. The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).
- Dresser, M. E., Giroux, C. N. Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast. The Journal of Cell Biology. , (1988).
- Lao, J. P., Cloud, V., et al. Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation. PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).
- Vonesch, C., Unser, M. A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the. IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).
