Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün
Summary
A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.
Abstract
The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.
Introduction
tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae kromozom fonksiyonunu kontrol eden proteinlerin çalışmaya dahil olmak üzere biyolojik süreçlerin moleküler mekanizmaları, çalışmaları için birçok avantaj sunuyor. , Moleküler genetik ve biyokimyasal çalışmalar için maya tomurcuklanan iyi bilinen avantajları olmasına rağmen, hücre çekirdeğinde bulunan protein dağılımının sitolojik çalışmalar küçük boyutu karmaşıktır. Tipik bir maya çekirdeği görünür ışığın sadece yaklaşık 5 katı çözünürlük sınırı olan en az bir mikron bir çapa sahiptir. Bu nedenle, geleneksel bir immün ya da, yeşil flüoresan protein (GFP) gibi floresan proteini etiketleri kullanılarak elde edilebilir, nükleer proteinlerin dağılımı hakkında bilgi miktarı sınırlıdır. Proteinlerin çekirdek içi dağılımı karakterize için yararlı bir yaklaşım, yayılma kromozom yüzeyidir. Bu yaklaşım, hücre duvarını kaldırarak hücre ve nükleer membranlar ve a kesintiye içerirllowing çekirdeğin çözünmeyen içeriğinin bir mikroskop lamı yüzeyi üzerine yerleştirmek. Çözünmeyen bileşenler, nükleer matris ve kromozom bulunmaktadır. Kromatin bağlı proteinleri tespit etmek için yeteneğini geliştirir çözülebilen çekirdek içindeki uzaklaştırılmasını sağlayan ek olarak, bu tür yayılmış çekirdek yaklaşık 3 um ila 5 arasında çaplara sahip (diploid mayoz çekirdekleri) kromozom önemli dekompresyonu yöntem sonucu yayılan kromozom ve 2 diploid mitotik çekirdekleri ila 3 um. Bu dekompresyon sağlam çekirdekleri gidermek için nispeten zor veya imkansız nükleer alt algılanmasını sağlar.
Yayılma kromozoma bariz bir eksiklik yayma işlemi ilgi yapısını bozan kısmen veya tamamen ihtimalidir. Özellikle endişe, belirli bir kromozom bağlı protein yayılan prosedürünün bir sonucu olarak kaybedilebilir olmasıdır. Bu potansiyel komplikasyon shouveri yorumlanırken ld akılda tutulmalıdır. Yayılma prosedüre karşı duyarlı olan bir proteinin bir örneği, beta-tubulin olup. Bazı koşullar altında, esas olarak tübülin oluşan mili, 3 yayılması sırasında korunur. Milin Görselleştirme genellikle ilgi çekirdeklerini sahne yararlıdır. Bununla birlikte, tubulin görselleştirme yüksek bir konsantrasyon sabitleyici tedavi gerektiren; iğ, aşağıda tarif edilen standart koşullar altında kaybolur. Bu örnek, daha önce uncharacterized proteinin dağılımını analiz ederken, bu proteinin böyle varyasyon ne kadar duyarlı belirlemek için sabitleştirici konsantrasyonunu değişir önemli olduğunu göstermektedir. Kromozom yapısına yayılan koşulların etkilerine ilişkin endişe rağmen, yayılma yöntemi yarar ve güç pek çok bağlamda gösterdiler ve mitoz karakterizasyonu ve özellikle mayotik hücreleri 4-7 geniş yarar sahiptir.
Two yayma yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Dresser ve Giroux'nun 8 tarafından geliştirilen bu yöntem, ilk olarak, deterjan kullanımını önler ve DNA spesifik boya DAPI lekeli göreceli olarak iyi korunmuş morfolojisinin sahip gibi görünmektedir yayılmış preparatları elde edilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem, mükemmel nispeten zordur ve bir sürgünün bir bölge, diğer bölgelere kıyasla zaman yayılmış çekirdeğin kalitesi, önemli ölçüde değişir. Bu sorun veri toplama önyargı önlemek için, bir slayt birçok seçilmemiş çekirdekleri görüntüleme içeren kantitatif yaklaşımların karmaşık hale getirebilir. Loidl ve Klein 1 tarafından geliştirilen yöntem yayılan ikinci kromozom, lizis ve deterjan çözeltisi tarafından teşvik kromatin dekompresyon ile, paraformaldehid ile fiksasyon dengeleme içerir. Düzgün yapıldığında, bu yöntem Dresser ve Giroux yöntemine göre daha az bölge için bölge varyasyon ile çok tekrarlanabilir sonuçlar verir. Bu sunum, bir tadil odaklanırnedeniyle güvenilirliğe ve sadeliğe sahip Loidl ve Klein yöntemine d versiyonu.
Kromozom yayma karmaşık ya da zaman alıcı değildir; 100'e kadar slaytlar tek bir gün içinde immün için hazırlanmış olabilir. Ayrıca, yayılma hazırlıkları öncesinde immün yıllarda dondurucuda saklanabilir ve böylece laboratuarları yeni biyolojik sorular ortaya ya da yeni boyama reaktifleri kullanılabilir hale kullanılabilen donmuş kromozom yayılır bir depo gelişebilir.
kromozom yayma yöntemi en sık immün ve widefield floresan mikroskobu ile birlikte kullanılır, ancak bu tür uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskopi olarak süper çözünürlüklü ışık mikroskobu yöntemleri için slaytlar hazırlamak da mümkündür olduğunu.
Protocol
Representative Results
Discussion
The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.
Materials
| Zymolyase | US Biological | Z1004 | Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use. |
| Lipsol | L.I.P. Ltd | no longer commercially available | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| NP-40 | USB | 19628 | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Slides | Corning | 2948-75×25 | |
| Standard coverslip | Fisher | 12-544-E or 12-540-B | |
| High resolution coverslips | Fisher | 12-542-B | |
| Photo-Flo 200 solution | Kodak | P-7417 | Prepare 0.2% (v/v) solution in water. |
| TBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8 | ||
| BSA | Sigma | A2153 | Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month. |
| Primary antibody | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit | Invitrogen | A-21206 | |
| IgG (H+L) Antibody | |||
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector Laboratories |
H-1200 | |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Plastic slide box | Fisher | 03-448-1 | Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber. |
| Cardboard slide box | Fisher | 12-587-10 | Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C. |
| Coplin jar | Fisher | 08-816 | Use as a wash basin for slides. |
Riferimenti
- Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).
- Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
- Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes. Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).
- Bishop, D. K. RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis. Cell. 79, 1081-1092 (1994).
- Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I. Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).
- Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis. PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).
- Biggins, S., Murray, A. W. The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).
- Dresser, M. E., Giroux, C. N. Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast. The Journal of Cell Biology. , (1988).
- Lao, J. P., Cloud, V., et al. Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation. PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).
- Vonesch, C., Unser, M. A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the. IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).
