Ytspridning och immunfärgning av Jäst Kromosomer
Summary
A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.
Abstract
The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.
Introduction
Den spirande jäst Saccharomyces cerevisiae erbjuder många fördelar för studier av molekylära mekanismer av biologiska processer, inklusive studier av proteiner som styr kromosom funktion. Även om det är väl kända fördelarna med knoppande jäst för genetiska, molekylära och biokemiska studier, är cytologiska studier av fördelningen av proteiner i cellens kärna kompliceras av dess ringa storlek. Den typiska jästkärnan har en diameter på mindre än en mikron, vilket är endast ca 5 gånger så hög upplösning gränsen för synligt ljus. Således, mängden information om fördelningen av nukleära proteiner som kan erhållas från konventionella immunfärgning eller genom att använda fluorescerande protein taggar, såsom grönt fluorescerande protein (GFP), är begränsad. En användbar metod för att karakterisera subnuclear fördelningen av proteiner är kromosomytan spridning. Detta tillvägagångssätt innebär att ta bort cellväggen, störa cell och nukleära membran, och enllowing de olösliga innehållet i kärnan för att reglera på ytan av ett objektglas. Dessa olösliga komponenter innefattar den nukleära matrisen och kromosomerna. Förutom att möjliggöra avlägsnande av lösliga nukleära innehållet, vilket ökar förmågan att detektera kromatin bundna proteiner, kromosomen spridnings metoden resulterar i betydande dekomprimering av kromosomer så att spridnings kärnorna har diametrar på cirka 3 till 5 ^ m (för diploida meiotiska kärnor) och 2 till 3 pm för diploida mitotiska kärnor. Denna dekomprimering tillåter detektion av kärnkonstruktion som är relativt svårt eller omöjligt att lösa i intakta kärnor.
En uppenbar brist till kromosom spridning är möjligheten att spridningsförfarandet helt eller delvis kan störa strukturen av intresse. Särskilt oroande är att en viss kromosombundet protein kan gå förlorade till följd av spridningsförfarandet. Denna potentiella komplikation should hållas i åtanke när man tolkar data. Ett exempel på ett protein som är känsligt för spridningsförfarandet är beta-tubulin. Under vissa förhållanden, spindeln, som består i huvudsak av tubulin, bevaras under spridning 3. Visualisering av spindeln är ofta användbart att iscensätta kärnor av intresse. Men visualisera tubulin kräver behandling med en hög koncentration fixerings; spindlar går förlorade under normala förhållanden som beskrivs nedan. Detta exempel illustrerar att, när man analyserar fördelningen av en tidigare okaraktäriserat protein är det viktigt att variera koncentrationen av fixativ för att avgöra hur känsliga proteinet är att sådana variationer. Trots oro effekterna av spridningsförhållanden på kromosom struktur har nytta och effekt av spridningsmetod visats i många sammanhang och har bred användning vid karakterisering av mitotisk och särskilt meiotiska celler 4-7.
Two spridningsmetoder har använts i stor omfattning. Den första av dessa metoder, som utvecklats av Dresser och Giroux 8, undviker användningen av tvättmedel och kan ge spridning preparat som verkar ha relativt välbevarad kromosom morfologi när färgas för DNA-specifika färgämnet DAPI. Det är dock relativt svårt att fullända denna metod och kvaliteten på spridda kärnor varierar kraftigt, när en region av en bild är jämfört med andra regioner. Detta problem kan komplicera kvantitativa metoder som involverar avbildning många omarkerade kärnor från en bild för att undvika datainsamling partiskhet. Den andra kromosom spridningsmetod, utvecklad av Loidl och Klein 1 innebär att balansera fixering av paraformaldehyd, med lys och kromatin dekompression främjas av en rengöringslösning. När korrekt utförd, ger denna metod mycket reproducerbara resultat med mindre region till region variation jämfört med Dresser och Giroux metod. Denna presentation fokuserar på en Modified version av metoden för Loidl och Klein, på grund av dess tillförlitlighet och enkelhet.
Kromosom spridning är inte komplicerat eller tidskrävande; upp till 100 objektglas kan framställas för immunfärgning på en enda dag. Vidare kan de spridda preparaten förvaras i frysen i åren före immunfärgning och sålunda laboratorier kan utveckla ett förvar av frysta kromosom uppslag som kan användas när nya biologiska frågor uppstår eller nya färgningsreagenser blir tillgängliga.
Kromosomen spridningsmetod är vanligast i kombination med immunfärgning och widefield fluorescensmikroskopi, men det är också möjligt att framställa bilder för superresolution ljusmikroskopiska metoder såsom stimulerad utarmning utsläppet (STED) mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.
Materials
| Zymolyase | US Biological | Z1004 | Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use. |
| Lipsol | L.I.P. Ltd | no longer commercially available | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| NP-40 | USB | 19628 | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Slides | Corning | 2948-75×25 | |
| Standard coverslip | Fisher | 12-544-E or 12-540-B | |
| High resolution coverslips | Fisher | 12-542-B | |
| Photo-Flo 200 solution | Kodak | P-7417 | Prepare 0.2% (v/v) solution in water. |
| TBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8 | ||
| BSA | Sigma | A2153 | Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month. |
| Primary antibody | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit | Invitrogen | A-21206 | |
| IgG (H+L) Antibody | |||
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector Laboratories |
H-1200 | |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Plastic slide box | Fisher | 03-448-1 | Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber. |
| Cardboard slide box | Fisher | 12-587-10 | Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C. |
| Coplin jar | Fisher | 08-816 | Use as a wash basin for slides. |
Riferimenti
- Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast. Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).
- Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
- Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes. Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).
- Bishop, D. K. RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis. Cell. 79, 1081-1092 (1994).
- Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I. Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).
- Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis. PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).
- Biggins, S., Murray, A. W. The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint. Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).
- Dresser, M. E., Giroux, C. N. Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast. The Journal of Cell Biology. , (1988).
- Lao, J. P., Cloud, V., et al. Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation. PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).
- Vonesch, C., Unser, M. A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the. IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).
