Le cellule Caco-2 possono servire come modello in vitro per studiare il trasporto degli enterociti dei lipidi e dei farmaci/vitamine liposolubili. Il sistema di membrane permeabili separa il compartimento apicale da quello basolaterale, mentre il sistema di espressione del lentivirus offre un metodo efficace di sovraespressione genica. L'isolamento delle lipoproteine è confermato dalla TEM.
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Articolo metodologico
Utilizzando cellule Caco-2 allo Studio Lipid Trasporto dall'intestino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli studi sull'assorbimento dei grassi alimentari sono generalmente condotti utilizzando un modello animale dotato di una cannula linfatica. Sebbene questo modello animale sia ampiamente accettato come modello in vivo di assorbimento dei grassi nella dieta, le tecniche chirurgiche coinvolte sono impegnative e costose. La manipolazione genetica del modello animale è anche costosa e richiede tempo. Il modello alternativo in vitro è probabilmente più conveniente, fa risparmiare tempo e meno impegnativo. È importante sottolineare che il modello in vitro consente agli investigatori di esaminare gli enterociti come un sistema isolato, riducendo la complessità inerente all'intero modello di organismo. Questo articolo descrive come le cellule di carcinoma del colon umano (Caco-2) possano fungere da modello in vitro per studiare il trasporto degli enterociti dei lipidi e dei farmaci liposolubili e delle vitamine. Spiega il corretto mantenimento delle cellule Caco-2 e la preparazione della loro miscela lipidica; E discute ulteriormente la preziosa opzione di utilizzare il sistema a membrana permeabile. Poiché le cellule Caco-2 differenziate sono polarizzate, il vantaggio principale dell'utilizzo del sistema a membrana permeabile è che separa il compartimento apicale da quello basolaterale. Di conseguenza, la miscela lipidica può essere aggiunta al compartimento apicale mentre le lipoproteine possono essere raccolte dal compartimento basolaterale. Inoltre, viene discussa l'efficacia del sistema di espressione del lentivirus nell'upregolazione dell'espressione genica nelle cellule Caco-2. Infine, questo articolo descrive come confermare il successo dell'isolamento delle lipoproteine intestinali mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
Introduzione
Studi di assorbimento intestinale dei grassi alimentari e farmaci e vitamine liposolubili possono essere condotti in vivo, utilizzando un modello di fistola linfatica 1-4. Tuttavia, le tecniche chirurgiche coinvolte non sono solo una sfida, ma anche costoso. Sebbene in vivo approcci basati sull'analisi fecale possono essere utilizzati, sono utilizzati principalmente per determinare la percentuale di assorbimento dal tratto gastrointestinale 2,5. Il modello in vitro descritto in questo documento è più conveniente, e le tecniche coinvolte sono forse meno impegnativo. Studi modificazione genetica sono anche più econom....
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Protocollo
1. Manutenzione delle cellule Caco-2
- Utilizzando regolari piastre di coltura tissutale
- Scongelare le cellule Caco-2 da una fiala congelata ponendo la provetta in un bagno d'acqua a 37 °, e subito aggiungerli a un piatto di coltura di tessuto al 10 cm contenente 10 ml di terreni di crescita (siero bovino fetale pre-riscaldato 15% (FBS ) in Dulbecco modificato (DMEM)).
- Quando le cellule Caco-2 hanno raggiunto 50-70% di confluenza, dividerle 1: 6 incubando le cellule con 3 ml di 0,05% tripsina / 0.53 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) a 37 ° C fino a quando sono staccati (15 min) . Per evitare aggregazione cellulare, mescolare....
- Scongelare le cellule Caco-2 da una fiala congelata ponendo la provetta in un bagno d'acqua a 37 °, e subito aggiungerli a un piatto di coltura di tessuto al 10 cm contenente 10 ml di terreni di crescita (siero bovino fetale pre-riscaldato 15% (FBS ) in Dulbecco modificato (DMEM)).
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Risultati
Figura 1 visualizza normali 13 giorni post-confluenti cellule Caco-2. La comparsa di strutture a forma di cupola e gocce lipidiche intracellulari sono caratteristici di differenziate cellule Caco-2. Quando le cellule Caco-2 non sono dispersi ugualmente durante la semina, si ciuffo e invadere in alcune zone del piatto; e ci saranno alcune aree nel piatto, senza tutte le cellule. Vorticoso e mettendo il piatto su una superficie inclinata deve essere evitata. E 'anche importante notare che il post-conf.......
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Discussione
In questo documento, i due sistemi che possono essere utilizzati per mantenere cellule Caco-2 sono descritte, cioè, il piatto di coltura tissutale regolare e la membrana permeabile. I vantaggi di utilizzare il sistema di membrana permeabile includono la separazione del apicale e basolaterale compartimenti, e la capacità di incubare la miscela lipidica e raccogliere la secrezione lipoproteina simultaneamente. Tuttavia, gli inserti membrana permeabile sono costosi, e la loro membrana di policarbonato non consentono una bu.......
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Dichiarazioni
L'autore non ha nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Seed Grant Award del California Northstate University College of Pharmacy (a AMN). Gli autori desiderano ringraziare il California Northstate University College of Pharmacy per aver coperto il costo di pubblicazione di questo articolo e George Talbott per il suo aiuto nella revisione di questo manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | VWR | 16750-112 | Preriscaldare il terreno di coltura in una singola piastra di coltura tissutale prima di aggiungere le cellule |
| FBS | Fisher | 3600511 | Non inattiviamo il nostro siero |
| Tripsina | VWR | 45000-660 | Le cellule possono essere lavate con PBS prima del trattamento con tripsina... |
| Sistema a membrana permeabile | Fisher | 7200173 | Piastra da 10 cm, dimensione dei pori 3 mm, membrana in policarbonato |
| Piastra da 10 cm | Fisher | 08-772-E | Piastra per coltura tissutale |
| Piastra da 15 cm | Fisher | 08-772-24 | Piastra per coltura tissutale |
| Piastra da 24 pozzetti | Fisher | 12565163 | Piastra per coltura tissutale |
| Reagente di trasfezione a base di lipidi | Fisher | PRE2691 | Può essere sostituito con un altro reagente di trasfezione |
| Terreno di coltura sierologico ridotto | Invitrogen | 11058021 | Per la trasfezione |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Filtro per flaconi | Fisher | 9761120 | 0,45 mm poro |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/ml |
| Acido oleico | Sigma | 01383-5G | Prevenire il ciclo di gelo-scongelamento |
| Lecitina | Fisher | IC10214625 | Lecitina d'uovo |
| Taurocolato di sodio | Fisher | NC9620276 | Prodotto fuori produzione; numero di catalogo alternativo: 50-121-7956 |
| Compressa cocktail di inibitori della proteasi (senza EDTA) | Fisher | 5892791001 | Utilizzato principalmente per campioni che necessitano di analisi TEM |
| Provetta per ultracentrifuga in policarbonato | Fisher | NC9696153 | Riutilizzandolo più volte si collasserà la provetta |
| Coperchio per provetta per ultracentrifuga | Fisher | NC9796914 | È necessario uno strumento per rimuovere il tubo/coperchio dal rotore |
| Siringa | Fisher | 50-949-261 | Filtro siringa monouso |
| Fisher | 09-719C | Dimensione dei pori = 0,2 mm; nylon | |
| Acido fosfotungstico | Fisher | AC208310250 | Per la preparazione di acido fosfotungstico al 2%, pH 6,0 |
| Pinzetta | Fisher | 50-238-62 | Extra fine e punte forti |
| Formvar/griglia in carbonio | Fisher | 50-260-34 | Formvar/film in carbonio griglia quadrata 400 Rame |
Riferimenti
- Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
- Nauli, A. M., et al.
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Ristampe e permessi
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