Un modèle 3D Culture hormone-sensibles de la glande mammaire humaine épithélium
Summary
We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.
Abstract
The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.
Introduction
Contrairement cultures 2D standard, culture cellulaire 3D modèles de substitution permettent l'étude du comportement des cellules épithéliales dans un contexte physiologiquement pertinente, l'un ressemble à un tissu. cultures 3D de la glande mammaire ont permis d'élucider de nombreux aspects du développement de la glande mammaire et la néoplasie. Cependant, la plupart des modèles de culture 3D actuellement ne conviennent pas pour étudier l'action des hormones parce que les lignées de cellules épithéliales humaines utilisées pour la tâche manquent de l'expression du récepteur d'hormone 6,7,9.
Nous décrivons ici un modèle de culture 3D de l'épithélium du sein humain qui est approprié pour étudier l'action de l'hormone 12. Ce modèle utilise la ligne disponible dans le commerce hormono-sensible humain epithelial du sein cellulaire T47D 3,11,13, qui ont été à l'origine dérivée d'une effusion pleurale provenant d'une patiente de 54 ans femelle avec un carcinome canalaire infiltrant du sein. Nous utilisons rat de type queue de collagène 1 comme matrice. Ce culte 3Dmodèle de ure est approprié pour l'étude de l'action des trois principales hormones mammotropic (estradiol, promégestone (un analogue de la progestérone), et de prolactine) sur les cellules épithéliales mammaires humaines. Hormone induit morphologie épithéliale peut être évaluée quantitativement au fil du temps par analyse morphométrique 12.
Une densité de semis appropriée permet à ces cultures 3D pour être conservés pendant 2 semaines. A cette époque, le développement de structures est suffisant pour une évaluation quantitative robuste de l'action des hormones sur la morphologie épithéliale. Les gels peuvent également être récoltées à des moments antérieurs pour la prolifération cellulaire et les analyses d'expression génique. En outre, ce modèle est adapté à tester les effets d'un traitement hormonal séquentiel; par exemple, après le traitement avec l'oestradiol pendant la première semaine et son remplacement par un autre hormone / combinaison d'hormones au cours de la semaine suivante. L'effet des composés oestrogéniques et anti-œstrogènes, tels que ICI 182,780, peut également être Stumortes en utilisant ce modèle de culture de 12 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here, we describe a hormone-sensitive 3D culture model to test the action of hormones on breast epithelium. The response to hormones can be assessed at the tissue morphology, cell proliferation and gene expression levels 12. One limitation of this technique is that visualization during the culture period is restricted to light microscopy since the cultures are grown in a plastic bottom plate. The 3D culture system could be adapted to glass bottom plates to allow for live imaging of the cultures 1.</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous apprécions grandement les contributions éditoriales par Cheryl Schaeberle. Cette recherche a été soutenue par des subventions Avon # 02-2009-093 et 02-2011-095 et NIEHS / NIH ES 08314 à AMS. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les positions officielles de l'Institut national des sciences de la santé de l'environnement ou de la National Institutes of Health.
Materials
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20mL | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
Riferimenti
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