Ein Hormon ansprechenden 3D-Kultur Modell des menschlichen Brustdrüse Epithel
Summary
We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.
Abstract
The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.
Introduction
Im Gegensatz zu Standard-2D-Kulturen erlauben Surrogat 3D-Zellkulturmodelle für die Untersuchung von epithelialen Zellverhalten in einem physiologisch relevanten Kontext man eine Gewebe ähnelt. 3D-Kulturen der Brustdrüse viele Aspekte der Brustdrüse Entwicklung und Neoplasie aufzuklären haben dazu beigetragen. Die Mehrzahl der 3D-Kulturmodellen jedoch derzeit verfügbar sind ungeeignet Hormonwirkung zu studieren, weil die menschlichen epithelialen Zelllinien für die Aufgabe eingesetzt 6,7,9 fehlt Hormonrezeptorexpression.
Hier beschreiben wir eine 3D-Kultur-Modell der menschlichen Brust-Epithel, die geeignet ist, um die Hormonwirkung 12 studieren. Dieses Modell verwendet die im Handel erhältlich Hormone ansprechenden menschlichen Brust epithelialen Zelllinie T47D 3,11,13, die ursprünglich von einem Pleuraerguss von einer 54-jährigen Patientin mit einer Infiltrations duktale Mammakarzinom erhalten abgeleitet wurden. Wir verwenden Rattenschwanz Kollagen vom Typ 1 als Matrix. Diese 3D-Kulture-Modell ist für die Untersuchung der Wirkung von den drei Haupt mammotropic Hormone (Östradiol, Promegeston (ein Analogon von Progesteron) und Prolaktin) angemessen auf die menschliche Brust Epithelzellen. Hormonbedingten können epitheliale Morphologie quantitativ im Laufe der Zeit durch morphometrische Analyse 12 bewertet werden.
Eine geeignete Aussaatdichte ermöglicht diese 3D-Kulturen für 2 Wochen aufbewahrt werden. Zu dieser Zeit ist die Entwicklung von Strukturen für eine ausreichend robust quantitative Bewertung der Hormonwirkung auf epitheliale Morphologie. Gele können auch zu früheren Zeitpunkten für die Zellproliferation und die Genexpression analysiert geerntet werden. Darüber hinaus ist dieses Modell die Auswirkungen einer sequentiellen Hormonbehandlung zu testen geeignet; zum Beispiel nach der Behandlung mit Estradiol während der ersten Woche und Austausch mit anderen Hormon / Kombination von Hormonen während der folgenden Woche. Die Wirkung des Östrogen-Verbindungen und Antiöstrogene, wie ICI 182,780, können auch stu werdenstarb dieses 3D-Kultur-Modell 12 mit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here, we describe a hormone-sensitive 3D culture model to test the action of hormones on breast epithelium. The response to hormones can be assessed at the tissue morphology, cell proliferation and gene expression levels 12. One limitation of this technique is that visualization during the culture period is restricted to light microscopy since the cultures are grown in a plastic bottom plate. The 3D culture system could be adapted to glass bottom plates to allow for live imaging of the cultures 1.</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir freuen uns über die redaktionellen Beiträge von Cheryl Schaeberle. Diese Forschung wurde unterstützt von Avon Grants # 02-2009-093 und 02-2011-095, und NIEHS / NIH ES 08314 zu AMS. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Institute of Environmental Health Sciences oder der National Institutes of Health vertreten.
Materials
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20mL | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
Riferimenti
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