ठोस लिपिड नैनोकणों (SLNs) Intracellular लक्ष्य निर्धारण के लिए एप्लीकेशन
Summary
In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.
Abstract
Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.
Introduction
Nanoparticle आधारित वितरण वाहनों विशेष सेलुलर संकेत और जीन अभिव्यक्ति को बदलने के लिए एक तंत्र प्रदान करने, इंट्रासेल्युलर को लक्षित अनुप्रयोगों के लिए महान वादा दिखाया है। इन वाहनों को दवाओं, प्रोटीन, और सेलुलर प्रतिक्रियाओं के प्रभाव और लक्ष्य ऊतकों में एक वांछित प्रभाव को प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया न्यूक्लिक एसिड के साथ लोड किया जा सकता है। Nanocarriers से कई प्रकार के लिपिड, पॉलिमर, सिलिकॉन, और चुंबकीय सामग्री सहित चिकित्सीय और नैदानिक लाभ के लिए पता लगाया गया है। इन पद्धतियों के कारण चिकित्सीय लक्ष्य ऊतकों में एकाग्रता, और प्रणालीगत विषाक्तता की कमी वृद्धि हुई स्थानीयकृत दवा वितरण के लिए अपनी क्षमता, के लिए आकर्षक हैं।
ठोस लिपिड नैनोकणों (SLNs) हाल के वर्षों में एक होनहार दवा वितरण वाहन के रूप में उभरा है कि एक nanoparticle वितरण प्रणाली की एक अच्छी तरह से अध्ययन उदाहरण हैं। SLNs आसानी से जैव संवेदन 1, सौंदर्य प्रसाधन 2, और टी सहित कई अनुप्रयोगों के लिए तैयार किया जा सकताherapeutic वितरण 3-7। उनकी उपयोगिता वे बढ़ाया biocompatibility, जिसके परिणामस्वरूप resorbable nontoxic, लिपिड की पूरी तरह से शामिल कर रहे हैं कि इस तथ्य से उपजा है। संश्लेषण के दौरान, lipophilic दवाओं जिससे parenteral प्रशासन के लिए दवा घुलनशीलता और उपयुक्तता बढ़ रही है, SLN वाहनों में शामिल किया जा सकता है। SLN वाहनों को भी उनके गिरावट और निकासी को कम करने, और उपचारात्मक कार्रवाई को अधिकतम समझाया चिकित्सा विज्ञान को स्थिर करने में मदद करते हैं। इन वाहनों की वजह से शरीर का तापमान 3,4,8,9 पर उनकी स्थिरता के लिए विशेष रूप से लंबे समय तक अभिनय, नियंत्रित रिहाई की तैयारी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। महत्वपूर्ण बात है, लिपिड नैनोकणों में दवाओं के encapsulation दवा अणुओं की आंतरिक फ़ार्माकोकायनेटिक प्रोफाइल बदल। यह एक संकीर्ण चिकित्सीय सूचकांक के साथ दवाओं की नियंत्रित रिहाई की अनुमति देकर एक संभावित लाभ प्रदान करता है। SLN-निगमित चिकित्सा विज्ञान की रिहाई की दर देखते लिपिड गिरावट की दर या में नशीली दवाओं के प्रसार दर के आधार पर की जा सकती हैलिपिड मैट्रिक्स।
SLNs अक्सर विशिष्ट लक्ष्य ऊतकों में जमा करने के लिए इंजीनियर हैं। उदाहरण के लिए, उनके आकार (आमतौर पर अधिक से अधिक 10 एनएम) ट्यूमर के ऊतक के टपकाया वाहिका बयान की सुविधा जहां परिसंचरण में प्रतिधारण potentiates। इसके अलावा, कण प्रशासन के मार्ग में इस तरह के लिम्फ नोड्स 10,11 के रूप में विशिष्ट शारीरिक संरचनाओं को निशाना बनाने की क्षमता के साथ biodistribution को बदलने के लिए दिखाया गया है। लक्ष्य ऊतकों में बयान, उचित सेलुलर बातचीत को प्राप्त करने और नैनोकणों के अंतिम internalization पर कारण चुनिंदा में और सेल 12 में से आयनों और अणुओं के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए कोशिका झिल्ली की क्षमता को चुनौती दे रहा है। सेलुलर तेज की सुविधा के लिए, यह पेप्टाइड्स, छोटे अणुओं, और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 13,14 सहित विशिष्ट ligands के साथ nanocarriers को संशोधित करने के लिए संभव है। निष्क्रिय पैठ और नैनोकणों के सक्रिय परिवहन सहित दोनों कई तंत्रकोशिका झिल्ली भर पहले से 3,12,15 वर्णित किया गया है। सामान्य में, यह सेल-nanoparticle बातचीत इस तरह के सेल प्रकार या सेल चक्र चरण 12 के रूप में सेल-विशिष्ट मानदंडों के अलावा, आकार, आकृति, सतह के प्रभारी और सतह के रसायन शास्त्र सहित नैनोकणों के भौतिक गुणों से प्रभावित हैं कि प्रदर्शन किया गया है।
पिछले एक जांच चरण उलटा तापमान (गड्ढे) विधि 17 का उपयोग कर 16 सामयिक और बायोमार्कर आवेदनों का पता लगाने के लिए 1 उप-10 एनएम SLNs के संश्लेषण का प्रदर्शन किया। इस तापमान धीरे-धीरे बदल रहा है, जबकि रचना निरंतर बनी हुई है, जहां 2 एक सज्जन संश्लेषण विधि है। गरम कर समाधान का निरंतर क्रियाशीलता, के रूप में यह एक nanoemulsion में आरटी परिणाम के लिए ठंडा। उस से भी छोटे कण आकार 1 के साथ SLNs के संश्लेषण में इस प्रक्रिया के परिणाम पहले से लिपिड नेन के संश्लेषण के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग कर सूचना दीoparticles 17-22। जिसके परिणामस्वरूप आकार पैमाने पर, कम से कम 20 एनएम, वृद्धि की वजह से सतह क्षेत्र और बढ़ाया सेलुलर बातचीत के लिए क्षमता के लिए इंट्रासेल्युलर लक्ष्यीकरण अनुप्रयोगों के लिए एक लाभ प्रदान करता है।
एक फ्लोरोसेंट रंजक या चिकित्सीय देने के लिए बनाया SLNs का एक योजनाबद्ध, चित्र 1 में दिखाया गया है। SLNs एक लिपिड आंतरिक (जैसे, रैखिक एल्केन) lipophilic यौगिकों (जैसे, रंग या चिकित्सा विज्ञान) के समावेश के लिए अनुमति देता है और एक surfactant बाहरी से मिलकर बनता है पानी से घिरा हुआ है (जैसे, रैखिक nonionic पृष्ठसक्रियकारक)। इस अध्ययन में, SLNs एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ भरी हुई थी और कण-सेल बातचीत की जांच के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया। प्राथमिक मानव त्वचीय fibroblasts और माउस वृक्ष के समान कोशिकाओं विषाक्तता और कण तेज करने के लिए सम्मान के साथ बातचीत को चिह्नित करने के क्रम में समय के साथ SLN से भरी हुई डाई करने के लिए अवगत कराया गया। एक 3 (4,5-dimethylthiazol-2-YL) -2,5-diphenylphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT) परख utili थाउचित खुराक के स्तर को स्थापित करने के क्रम में जेड। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry इन विट्रो में कण तेज की जांच करने के लिए कार्यरत दो तरीकों थे।
प्रमुख घटक दिखा SLN की चित्रा 1. योजनाबद्ध। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, SLNs के संश्लेषण और intracellular को निशाना बनाने के लिए आवेदन पत्र उनकी प्रयोज्यता पता लगाया गया। ये biocompatible नैनोकणों दवा वितरण, जीन मुंह बंद करने, और टीका प्रौद्योगिकियों 25-30 सहित कई अनुप्रयोगों ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory’s Research and Exploratory Development Department, Office of Technology Transfer, and Stuart S. Janney Fellowship Program, in addition to the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number R21HL127355.
Materials
| Nile Red (NiR) | Sigma | 19123 | BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0% |
| Heneicosane | Aldrich | 286052 | 98% |
| Brij O10 | Sigma | P6136 | Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether |
| Water | Sigma | W3500 | Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding | Life Sciences | PN4612 | Non-Pyrogenic |
| Nanotrac Ultra | Microtrac | serial number U1985IS | Instrument |
| Differential Scanning Calorimeter | Mettlet-Toledo | —- | Instument |
| Primary human fibroblasts | Life Technologies | C-004-5C | Neonatal (HDFn) |
| Medium 106 | Life Technologies | M-106-500 | A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts. |
| Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Life Technologies | S-003-K | All the components of complete LSGS |
| MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-025-K | Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3,[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) |
| Safire2 microplate reader | Tecan | —- | Instrument |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P5493 | For molecular biology |
| Recombinant murine GM-CSF | R&D Systems | 415 | >97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain. |
| Recombinant murine IL-4 | R&D Systems | 404 | >97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain. |
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