ניתוח של<em> Enterocolitica Yersinia</em> מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions
Summary
Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.
Abstract
חיידקי גרם שלילי רבים, כולל spp Yersinia פתוגניים. להעסיק סוג שלישי מערכות הפרשה לtranslocate חלבוני מפעיל לתאי יעד האיקריוטים. בתוך התא המארח חלבוני מפעיל לתפעל פונקציות סלולריות לטובת החיידקים. כדי להבין את השליטה של הפרשת III הסוג במהלך אינטראקציה תא מארח, רגישה ומבחנים מדויקים יותר למדידת טרנסלוקציה נדרשים. אנחנו כאן לתאר את היישום של assay המבוסס על השילוב של שבר חלבון מפעיל Yersinia enterocolitica (חלבון החיצוני Yersinia; YopE). עם TEM-1 בטא לקטמאז לניתוח כמותי של טרנסלוקציה assay מסתמך על מחשוף של תא permeant סריג צבע (CCF4 / AM) על ידי היתוך בטא לקטמאז translocated. לאחר המחשוף של ליבת צפלוספורין של CCF4 ידי בטא לקטמאז, סריג מcoumarin להעמסה מופרת והעירור של מחצית coumarin מוביל לפליטת הקרינה כחולה.יישומים שונים של שיטה זו תוארו בספרות הדגשה צדדיות שלה. השיטה מאפשרת ניתוח של טרנסלוקציה במבחנה וגם בin vivo, למשל, במודל של עכברים. זיהוי של אותות הקרינה יכול להתבצע באמצעות קוראי צלחת, ניתוח FACS או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בהתקנה המתוארת כאן, בטרנסלוקציה מבחנה של שילובי מפעיל לתאי הלה על ידי מוטציות Yersinia שונות מנוטר על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר. הקלטת המרה תאית של כתב סריג על ידי היתוך מפעיל בטא לקטמאז בזמן אמת מספקת תוצאות כמותיות חזקות. אנחנו כאן להראות נתונים למופת, מדגימים טרנסלוקציה המוגברת על ידי י ' המוטציה enterocolitica YopE בהשוואה לזן מהסוג בר.
Introduction
III מערכות הפרשת סוג מכונות חלבון-יצוא מיוחד מנוצל על ידי genera של חיידקי גרם שלילי לספק ישירות חלבוני מפעיל מקודדים bacterially לתאי יעד האיקריוטים שונה. בעוד מכונות ההפרשה עצמו שמור ביותר, סטים מיוחדים של חלבוני מפעיל התפתחו בין מיני חיידקים השונים כדי לתפעל מסלולי איתות תאיים ולהקל אסטרטגיות אלימות חיידקים ספציפיות 1. במקרה של Yersinia, עד שבעה חלבוני מפעיל, (חלבונים חיצוניים Yersinia) Yops שנקרא, הם translocated במגע תא מארח ולפעול יחד כדי לחתור תחת תגובות תא חיסון כגון ייצור phagocytosis וציטוקינים, כלומר, כדי לאפשר הישרדות תאית של החיידקים 2-4. התהליך של טרנסלוקציה נשלט בחוזקה בשלבים שונים 5. הוא קבע כי הפעלה ראשונית של T3SS מופעלת על ידי המגע שלה ליעד לספירהLL 6. עם זאת, המנגנון המדויק של חניכה זו הוא עדיין לא הובהר. בYersinia רמה שנייה של מה שנקרא כוונון עדין של טרנסלוקציה מושגת על ידי למעלה או פעילות של חלבוני Rho GTP מחייב Rac1 הסלולריים או RhoA ויסות כלפי מטה. הפעלה של Rac1 למשל על ידי גורם necrotizing invasin או ציטוטוקסיות Y (CNF-Y) מובילה לטרנסלוקציה עלתה 7-9, ואילו הפער (GTPase הפעלת חלבון) פונקציה של YopE translocated מסדירה את הפעילות-Rac1 ובהתאם יורד טרנסלוקציה ידי סוג משוב שלילי של מנגנון 10,11.
שיטות תקפות ומדויקות הן התנאי ההכרחי כדי לחקור כיצד טרנסלוקציה מוסדרת במהלך האינטראקציה תא המארח Yersinia. מערכות רבות ושונות המשמשות למטרה זו, כל אחד עם יתרונות וחסרונות מסוימים. גישות יש להסתמך על תמוגה של תאים נגועים אך לא חיידקים על ידי חומרי ניקוי שונים ואחריו ניתוח כתם מערבי. החסרון משותף דואר של שיטות אלה הוא שתמוגה חיידקי קטין אך בלתי נמנעת שעלולה מזהמת את lysate התא עם הקשורים חיידקי חלבוני מפעיל. עם זאת, טיפול בתאים עם K proteinase להשפיל חלבוני מפעיל תאיים והשימוש הבא של digitonin לתמוגה סלקטיבית של התאים האיקריוטים הוצעו כדי למזער בעיה זו 12. חשוב לציין, מבחני אלה תלויים באופן מכריע על נוגדנים נגד מפעיל באיכות גבוהה, שהם בעיקר לא זמינים באופן מסחרי. ניסיונות להשתמש שילובי translational של חלבוני מפעיל וחלבוני ניאון כמו GFP לעקוב אחר טרנסלוקציה לא היו מוצלחים ככל הנראה בשל המבנה הכדורי שיישונים של חלבוני הניאון וחוסר היכולת של מנגנון ההפרשה להתפתח לפני ההפרשה 13. עם זאת תחום, כמה תגי כתב שונים כמו cya (cyclase adenylate calmodulin תלוי) של רעלן שעלת Bordetella cyclolysin 14 או פלאשתג שימש בהצלחה לניתוח טרנסלוקציה. בassay לשעבר הפעילות האנזימטית של cya משמשת כדי להגביר את האות של חלבון ההיתוך תאיים, ואילו תג פלאש, תג מוטיב tetracysteine קצר מאוד (4Cys), מאפשר לתיוג עם פלאש הצבע biarsenical מבלי להפריע לתהליך של הפרשה 15.
הגישה מיושמת כאן דווחה לראשונה על ידי שרפנטייה et al., והוא מבוסס על ההמרה תאית של CCF4 צבע תהודת העברת אנרגיית פורסטר (סריג) על ידי שילובי translocated מפעיל TEM-1 בטא לקטמאז 16 (איור 1 א). CCF4 / AM הוא תרכובת תא-permeant בי נגזר coumarin (תורם) ומחצית העמסה (acceptor) צמודות על ידי ליבת צפלוספורין. עם הכניסה פסיבית לתוך התא אוקריוטים, לא פלורסנט אסטרי מתחם CCF4 / AM מעובד על ידי esterases הסלולרי לCCF4 הטעון וניאון ולכודים ובכךבתוך התא. עירור של מחצית coumarin ב 405 ננומטר תוצאות בסריג למחצית והעמסת, אשר פולטת אותות הקרינה ירוקים ב530 ננומטר. לאחר המחשוף של ליבת צפלוספורין ידי סריג בטא לקטמאז מופר ועירור של מחצית coumarin מוביל לפליטת הקרינה הכחולה at460 ננומטר. יישומים שונים של שיטה זו תוארו בספרות הדגשה צדדיות שלה. השיטה מאפשרת ניתוח של טרנסלוקציה במבחנה וגם בin vivo, למשל, את הטכניקה הייתה בשימוש במודל זיהום עכבר כדי לזהות את אוכלוסיות יקוציט ממוקדות עבור טרנסלוקציה in vivo 17-19. קריאת נתונים של אותות ניתן לבצע באמצעות קוראי צלחת, ניתוח FACS או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראוי לציין, השיטה מספקת גם את האפשרות לעקוב אחר טרנסלוקציה בזמן אמת על ידי מיקרוסקופ לחיות התאים במהלך 20,21 תהליך ההדבקה. כאן מיקרוסקופ פלואורסצנטי סריקת הלייזר יושם לreadouלא של אותות הקרינה כפי שהוא מספק רגישות ודיוק הגבוהות ביותר. בפרט, את היכולת להתאים את חלון הפליטה עם דיוק ננומטר בשילוב עם גלאים גבוהים רגישים מקל מותאמת גילוי הקרינה ולמזער הצטלבות. בנוסף התקנת מיקרוסקופיה זה יכולה להיות מותאם לניטור של טרנסלוקציה בזמן אמת ובאופן פוטנציאלי מאפשרת לניתוח בו זמני של אינטראקציה מארח הפתוגן ברמה התאית.
בשיעורי טרנסלוקציה מחקר זה של י ' זן enterocolitica פראי סוג ומוטצית מחיקת YopE מציגה פנוטיפ hypertranslocator 10,11 נותחו exemplarily.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנחנו כאן מיושמים בהצלחה מבוססת assay כתב בטא לקטמאז TEM-1 לניתוח כמותי של טרנסלוקציה מפעיל על ידי י ' enterocolitica. וריאציות שונות של טכניקה רגישה, ספציפית ופשוטה יחסית זו תוארו בספרות. במחקר זה מיקרוסקופ סריקת לייזר נערך לגילוי רגיש והמדויק ביותר של אותות הקרינה. באופ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.
Materials
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
Riferimenti
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia’s stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
