Hier presenteren we een protocol dat is gebaseerd op gekweekt ruggemerg segmenten op multi-elektrode arrays functionele regeneratie van propriospinal verbindingen di vitro bestuderen.
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
Organotypische slice cultures van het centrale zenuwstelsel (CNS) zijn uitgebreid gebruikt voor diverse fysiologische en pathologische fenomenen bereiken van neuronale ontwikkeling tot neurodegeneratie. Vergeleken met gedissocieerde celkweken, organotypische plakken het voordeel meer complexiteit met een intacte cytoarchitecture en lokale synaptische circuits. Tegelijkertijd kan het weefsel op een geïsoleerde wijze geanalyseerd zonder dat de complexiteit van de hele impliceren in vivo context. Verder is gemakkelijk en herhaalde toegang tot de cellen van keuze waarborgt de extracellulaire omgeving kan nauwkeurig worden geregeld en meestal in vitro modellen zijn minder kostbaar dan hun tegenhangers in vivo. De laatste jaren diverse studies die opvallende gelijkenissen tussen de ontwikkelingsprofielen van kweken op lange termijn versus de overeenkomstige levende dieren 1,2. Het is aangetoond dat neuronale circuits van verschillende CNS regions uiten spontaan netwerk activiteit tijdens de ontwikkeling en dat organotypische plakjes dit fenomeen 3 -7 gedeeltelijk te handhaven. Geïsoleerde ruggenmerg preparaten zijn bijzonder genoemd ritme opwekking 6 en de vorming van neuronale circuits 1 te onderzoeken.
Een manier om de spontane activiteit van organotypische plakjes opnemen is cultuur deze naar multielektroden (MEA). Deze apparaten bevatten meerdere elektroden die de extracellulaire potentialen gegenereerd door actiepotentialen van talrijke cellen tegelijk (multi-unit opname) kan controleren. De hoge tijdsresolutie van de MEA opnamen kan worden gebruikt om de precieze activiteit dynamiek binnen een bepaalde neuronale circuit reconstrueren. Bovendien, in tegenstelling tot patch-klemmen van de techniek is niet-invasief, waarbij langetermijnmetingen en resultaten maakt het feit dat de neuronen niet worden aangetast in hun gedrag.
Fof het doel van deze studie was de combinatie van organotypische ruggenmerg co-kweken en multisite opnames werd gebruikt om functionele regeneratie in het ruggenmerg te onderzoeken. Sinds volwassen hogere gewervelden hebben beperkte mogelijkheden om te herstellen van schade aan het ruggenmerg, zijn verschillende strategieën bestudeerd om de regeneratie na een dwarslaesie te promoten. Tot nu toe heeft de corticospinale darmkanaal meestal al het modelsysteem van de keuze voor dergelijke onderzoeken. Deze experimenten zijn meestal tijdrovend, kostbaar en vereisen grote dierlijke cohorten door hoge variabiliteit tussen enkele groepen. Bovendien zijn er aanwijzingen dat propriospinal aansluitingen (neuronen die volledig worden opgesloten in het ruggenmerg) een centrale rol in het herstelproces volgende ruggenmergletsels 8 kan spelen. Deze vezels zijn moeilijk te bestuderen in vivo zonder tussenkomst van stijgende en dalende fiber traktaten. Bonnici en Kapfhammer 9 gebruikte longitudinale ruggenmergslice culturen van postnatale muizen als alternatieve benadering. Na het uitvoeren van mechanische laesies geanalyseerd ze semi-kwantitatief de morfologische regeneratie van axonen tussen ruggenmerg segmenten. Zij merkten minder, maar niet niemand axonen oversteken van de laesie site in culturen gesneden op een volwassen leeftijd. Daarentegen kweken die werden laesie op jongere stadium vertoonden een hoog gehalte van axonale regeneratie 5 – 7 dagen na de beschadiging. Echter, het bewijs voor functionele verbindingen werd niet gepresenteerd.
Daarom kan de ontwikkeling van een representatief in vitro model van propriospinal vezels die het onderzoek naar functionele regeneratie kan een waardevol instrument om onze kennis op gebied van regeneratieve processen in het ruggenmerg.
Verschillende elementen in de gepresenteerde procedure zijn van fundamenteel belang voor de verwezenlijking van nauwkeurige en reproduceerbare experimenten. Alle stappen tijdens de bereiding van de MEA, oplossingen en de productie van de slice cultures worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. Antibiotica worden niet toegepast op het voedingsmedium omdat de spontane activiteit 14 kan beïnvloeden. Tijdens de MEA coating, het belangrijkste deel is ervoor te zorgen dat de extracellulaire matrix geloplossing koud blijft te allen tijde. Dooi in de koelkast en houdt het op ijs gedurende de gehele procedure een maximale temperatuur dichtbij 0 ° C te garanderen. Tijdens de voorbereiding van de plakjes snelle isolatie en snijden, alsmede aandacht voor een lage temperatuur met ijskoude dissectie buffers verhoogt het percentage gezonde culturen. Bovendien is de plasma / trombine coagulatie is een van de meest kritische stappen. Zorg er eerst voor dat het plasma is goed mixed met trombine. Tweede, bijzondere aandacht besteden aan het verwijderen van zo veel residu mogelijk om een goede bevestiging van de plakjes op de MEA waarborgen. Deze stap is zeer tijdgevoelige; als de tijd te kort, te veel van het plasma / trombine mengsel wordt verwijderd. Als de tijd te lang is, coagulatie al gebeurd, waardoor het risico van het verwijderen van de plakken met de overgebleven plasma / trombine.
Als mechanische laesies gepland, is het belangrijk om MEA te gebruiken met een nauwkeurige vormgeving. Het gebied waar de laesie bestemd moet vrij elektroden, draden en isolatie zijn. Anders, de elektra van de MEA zullen worden beschadigd en daarom kunnen er geen opnames meer worden uitgevoerd.
Een andere cruciale stap betreft de grootte van de laesie. Het is eerder aangetoond dat het opnieuw aansluiten van twee jonge plakken na laesie duurt ongeveer twee dagen 10. Voor alle experimenten, de vuistregel werd gebruikt dat de ruimte between de plakken na laesie mag niet groter zijn dan de breedte van de MEA groef (300 pm) zijn. Een grotere laesie grootte kan resulteren in een langere termijn voor heraansluiting of, als het letsel is te groot, geen heraansluiting helemaal. Annoteren, vroegere experimenten bleek dat een eerste plaatsing van de twee plakken verder dan 1 mm resulteert in een zeer lage verbindingssnelheid.
Voor de start van de opnamen, een aanpassing van ten minste 10 min tot kamertemperatuur in plaats van 37 ° C incubator, en de extracellulaire oplossing, in plaats van het voedings- medium wordt aanbevolen. Nauwkeurige observatie van de activiteit patroon tijdens deze eerste minuten zorgt ervoor dat de meetgegevens vertegenwoordigen het uiteenspatten patroon van de cultuur op de juiste wijze na de opname werd gestart.
Voor de detectie van de activiteit, data acquisitie en verdere verwerking, zelfgemaakte hardware (opname kamer, leidingen naar de versterkers en versterkers), programma's LabVIEW, C ++ en IgorPro gebruikt. Commerciële MEA setups en andere software pakketten zijn ook geschikt voor deze operaties. Hier zijn de signalen gezien door de elektroden worden versterkt 1001 keer, en vervolgens gedigitaliseerd met een frequentie van 6 kHz.
De gepresenteerde model kan een nuttig hulpmiddel voor propriospinal verbindingen te onderzoeken omdat in vivo, zijn ze moeilijk te bestuderen zonder tussenkomst van stijgende en dalende zenuwbanen. De co-kweken van twee ruggenmerg plakken kan dit probleem elegant omzeilen. De kweken leveren een micro die strak gecontroleerd en gemakkelijk gemanipuleerd kunnen. Anderzijds, supraspinale en sensorische input natuurlijk ontbreekt. Bovendien is de werkwijze van de kweek preparaat geeft een situatie van CNS-letsel. Gliale cellen zoals astrocyten en microglia zijn bekend reageren letsels met verhoogde proliferatie en derhalve het weefsel zekere mate gereorganiseerd. Betreffende de gepresenteerde model de vorming van een gliale litteken na het uitvoeren van mechanische laesies niet waargenomen. Een verklaring zou kunnen zijn dat aanpassingsmechanismen van astrocyten reeds werden geactiveerd tijdens het bereidingsproces en laesies van de kweken niet tot een verdere reactie. Ook is er geen bewijs voor de betrokkenheid van myeline geassocieerde remmers, bijv., Nogo-A, de lage regeneratiepotentieel van culturen gelaedeerde op hoge leeftijd. Er werd aangetoond dat behandeling met de fosfodiesterase 4 inhibitor Rolipram direct begint na het uitvoeren van laesies 23 DIV verhogingen functionele regeneratie tussen de segmenten 10. Deze resultaten demonstreren dat functioneel herstel in oude culturen worden verhoogd. Merkbaar, bij het tellen van het aantal axonen oversteken van de laesie site, geen verschil tussen culturen laesie op jonge leeftijd en culturen laesie op een oude leeftijd werd ontdekt. Deze bevindingen suggereren dat het ontbreken van axonale regeneratie is niet de belangrijkste reden fof het verlies van herstel na late laesies in de cultuur en daarom benadrukken de noodzaak van een model dat de functionele analyse van de wedergeboorte maakt. Synaptische vorming en de synaptische plasticiteit kan een belangrijke rol in het herstelproces 10 spelen. Deze mechanismen kreeg veel aandacht in de afgelopen jaren en het wordt tegenwoordig algemeen aanvaard dat ze een grote invloed op de uitkomst na dwarslaesie. Daarom kan een model dat stabiele gebied zorgt deze processen afzonderlijk en in detail te onderzoeken zeker helpen inzicht functionele regeneratie in het ruggenmerg te verkrijgen.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |