Identifisering av kinase-substrat Pairs Bruke Høy throughput screening

Summary

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Abstract

Vi har utviklet en plattform for screening for å identifisere humane dedikerte proteinkinaser for fosforylerte substrater som kan brukes til å belyse nye signaltransduksjonsveier. Vår tilnærming har den bruk av et bibliotek av renset GST-merket human proteinkinaser og et rekombinant protein substrat av interesse. Vi har brukt denne teknologien for å identifisere MAP / microtubule affinitet regulerende kinase 2 (Mark2) som kinase for en glukose-regulert område på CREB-regulert Transkripsjonell Coactivator 2 (CRTC2), et protein som kreves for beta-celle proliferasjon, samt Axl familie av tyrosin kinaser som regulatorer av celle metastase ved fosforylering av adapteren protein ELMO. Vi beskriver denne teknologien, og diskutere hvordan det kan bidra til å etablere et helhetlig kart over hvordan cellene reagerer på miljømessige stimuli.

Introduction

Protein post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs) er avgjørende for intracellulær kommunikasjon. Kanskje den beste studert av alt PTMs er fosforylering, katalysert av protein kinaser som regulerer et mylder av protein funksjoner, inkludert deres biokjemiske aktivitet, subcellulære lokalisering, konformasjon, og stabilitet. Identifiseringen av fosforyleringsseter på målproteiner kan oppnås ved tryptisk kartlegging eller phosphopeptide nå er standard proteomic teknikker ved bruk av prøver anriket for fosforpeptider ^1,2. Mens tre fjerdedeler av det uttrykte proteom- forventes å bli fosforylert ^tre og en identifisert 200.000 fosforyleringsseter ^5, med anslag opp til 1 million ^6, mange av disse har ingen tildelt biologi, signalveien, eller protein kinase.

Mens identifisering av fosforylerte nettsteder er relativt grei, en forholdsvis større utfordring er åidentifisere beslektet kinase (e) som er rettet mot disse områdene, en prosess vi kaller kartlegging kinase: substrat par. Flere metoder for identifisering av kinase: substrat-par er blitt beskrevet, enten å starte med en kinase av interesse og ser etter dens underlag eller å starte med et substrat av interesse og å forsøke å finne en modifiserende kinase eksperimentelt ^{7-11 eller 12} beregningsmessig. For å identifisere kinaser kjent for en fosforylert substrat, kan bioinformatikk anvendes for å identifisere proteiner som inneholder en kort konservert sekvens av aminosyrer som flankerer den fosforylerte rest (konsensus-området), i tillegg til å identifisere kinaser som danner en utfellbar kompleks med substratet. Disse metodene er tidkrevende og ofte tilfredsstiller ikke med hell.

Vi utviklet en systematisk funksjonell tilnærming til raskt å identifisere kinaser som kan fosforylerer et gitt substrat ^13. Skjermen analysen produserer utmerket spesifikkligheten, med veldig klart valg for potensielle beslektede kinaser. Gitt sentralitet fosforylering til biologisk signalering, er skjermen nyttig for funn i nesten alle cellesignalveier ^14-16. Skjermen innebærer å utføre en storskala kinaseanalyse med et bibliotek av menneskelige proteinkinaser. De kinaser er merket med bakteriell glutation S-transferase (GST) protein og renses fra pattedyrcelleekstrakter, noe som betyr at de rekombinante enzymene – i motsetning til de som fremstilles fra bakterier – genereres i nærvær av oppstrøms proteinkinaser ofte kreves for rekombinante enzymer for å ha aktivitet in vitro. Faktisk, mens serin, treonin og tyrosin-kinase-aktivitet som er nødvendig for nedstrøms-kinase-aktivering er til stede i gjær ^10, koder for gjærgenomet 122 proteinkinaser, noe som indikerer at pattedyr kinome, med over 500 gener ^17, er blitt vesentlig mer komplisert for å kunne regulate prosessene som er unike for høyere ordens organismer. Dessuten kan virkningen av forskjellige stimuli som er relevante for cellebiologi og human sykdom (for eksempel små molekyler, vekstfaktorer, hormoner, etc.) bli brukt til ^14,15 modulen kinase-aktivitet i en passende sammenheng.

Protocol

1. Utarbeidelse av reagenser, plater, og celler Gjør 500 ml lyseringsbuffer: 25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% TritonX-100, 5 mM beta-glycerofosfat, 5% glycerol. Oppbevar ved 4 ° C. Umiddelbart før bruk, tilsett 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), og 1 mM natrium-vanadat. Etter dette trinnet blir PMSF ikke nødvendig i noen skyllebuffer. Gjøre 20 ml 10 x kinase-buffer: 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-glycerofosfat (FW 216), 2 mM natriu…

Representative Results

Representative resultater fra en skjerm er vist i figur 2. 180 kinaser ble screenet ved anvendelse av en GST-merket peptid substrat svarende til aa 268-283 fra CRTC2 så vel som den klassiske kinaseanalyse substrat myelin basisk protein (MBP). Bare to kinaser, Mark2 og svært knyttet kinase MARK3 fosforylert den CRTC2 peptid. MBP er inkludert som en intern kontroll i alle analyser, da den inneholder mange phosphorylatable rester og kjører på 18 kDa, mot bunnen av gelen. Dette gjør det mulig for en to…

Discussion

Siden de opprinnelige publikasjonene beskriver tilnærmingen ^14,15, har den opprinnelige bibliotek av 180 GST-kinaser er utvidet til 420 medlemmer, eller ~ 80% av det humane proteinet kinome. Med det utvidede biblioteket, protokollen som beskrevet tar 4-5 dager og deretter 1-4 dager for å utvikle film (som anses nødvendig), som kan bli forkortet ved anvendelse av phosphorimaging og digital signalforbedring. Det er flere viktige skritt der omsorg må tas (Se figur 1 for over…

Materials

Lysis buffer	Made in house		See Protocol step 1.1
10x kinase buffer	Made in house		See Protocol step 1.2
10x M-ATP	Made in house		See Protocol step 1.3
Human kinase plasmids	Orfeome, Invitrogen, Origene		GST-tagged in house
96 well plates	Fisher Scientific	CS003595
293T cells	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	supplement with 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.
CO2 incubator	Sanyo	MCO-17AIC
15 cm cell culture dishes	Fisher Scientific	877224
Reduced serum medium	Invitrogen	22600-050
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen	11668-019
Automated liquid dispenser	Thermo Scientific	5840300
Small cassette attachment	Thermo Scientific	24073295
Standard cassette attachment	Thermo Scientific	14072670
4mM pervanadate	Made in house		See Protocol step 3.1
0.25 M CaCl2	Made in house
Multichannel pipette (20-200 uL)	Labnet	p4812-200
Multichannel pipette (1-10 uL)	Thermo Scientific	4661040
V-bottom 6-well plates	Evergreen Scientific	290-8116-01V
Glutathione coated 96-well plates	Fisher Scientific	PI-15240
Hybridization oven	Biostad	350355
GST tagged substrate	Made in house
Myelin Basic Protein (MBP)	Sigma	M1891
Repeater pipette (1 mL)	Eppendorf	22266209
32P gamma-ATP	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2X SDS lysis buffer (100 mL)	Made in house		See Protocol step 1.4
26-well precast TGX gels	BioRad	567-1045	gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest
Coomassie stain	Made in house		0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol
Coomassie destain	Made in house		10% acetic acid, 20% methanol
Labeled gel containers	Made in house		Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel
Whatman filter paper	Fisher Scientific	57144
Cellophane sheets (2)	BioRad	165-0963
Gel dryer	Labconco	4330150
Double emulsion autoradiography film	VWR	IB1651454
Film cassette	Fisher Scientific	FBAC-1417
Intensifying screen	Fisher Scientific	FBIS-1417
Plate sealing rubber roller	Sigma	R1275