تصوير الاتجار بين الخلايا من APP مع GFP Photoactivatable
Summary
في حين يتم نقل البروتينات سطح الخلية درس بسهولة نسبيا، تصور الاتجار البروتينات داخل الخلايا هو أكثر صعوبة بكثير. هنا، فإننا نستخدم بنيات دمج GFP photoactivatable ويبرهن على وجود طريقة لمتابعة بدقة بروتين اميلويد السلائف من جهاز جولجي إلى المقصورات أسفل مجرى وتابع إزالة لها.
Abstract
بيتا اميلويد (Aβ) هو المكون الرئيسي لويحات خرف وجدت في أدمغة مرضى الزهايمر. مشتق Aβ من انشقاق متتابعة من اميلويد السلائف البروتين (APP) من خلال β وγ-secretases. وعلى الرغم من أهمية Aβ إلى AD علم الأمراض، لا راسخة توطين التحت خلوية من هذه الانقسامات. العمل في مختبرنا وغيرها توريط النظام endosomal / الليزوزومية في معالجة APP بعد استيعاب من سطح الخلية. ومع ذلك، فإن الاتجار داخل الخلايا APP هو دراسة سلوكه نسبيا.
بينما البروتينات على سطح الخلية قابلة للتعديل إلى العديد من التقنيات وصفها، لا توجد طرق بسيطة لمتابعة الاتجار بروتينات الغشاء من جولجي. تحقيقا لهذه الغاية، أنشأنا بنيات APP التي تم الموسومة ب-صورة activatable GFP (paGFP) في محطة سي. بعد التوليف، paGFP ديها منخفضة مضان القاعدية، ولكن يمكن حفز مع 413 نانومتر ضوء رس إنتاج، مخضر قوي مستقر. باستخدام جولجي علامة Galactosyl ترانسفيراز بالإضافة إلى البروتين سماوي نيون (جالت-CFP) كهدف، ونحن قادرون على APP photoactivate بدقة في شبكة عابرة للجولجي. تنشيط الصور APP-paGFP ثم يمكن اتباعها لأنها بالاتجار إلى حجرات المصب تحديدها مع الموسومة fluorescently البروتينات علامة المقصورة لالاندوسوم في وقت مبكر (Rab5)، المرحوم الاندوسوم (Rab9) ويحلول (LAMP1). وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام مثبطات لمعالجة APP بما في ذلك الكلوروكين أو γ-secretase المانع L685، 458، ونحن قادرون على إجراء تجارب نبض مطاردة لدراسة تجهيز APP في الخلايا وحيدة.
نجد أن نسبة كبيرة من APP يتحرك بسرعة ليحلول دون الظهور على سطح الخلية، ومن ثم يتم مسح من يحلول من قبل الانشقاقات مثل secretase. توضح هذه التقنية فائدة paGFP لمتابعة الاتجار وتصنيع البروتينات داخل الخلايا جيئة وذهابام غولجي إلى حجرات المصب.
Introduction
السمة المميزة لمرض الزهايمر (AD) هي وجود لويحات خرف والتشابك الليفي العصبي (NFTS) في الدماغ. الرئيسية المكونة لويحات خرف هو بيتا اميلويد (Aβ). مشتق Aβ من السلائف. بروتين اميلويد السلائف (APP) 1. الانقسام amyloidogenic من APP يبدأ مع إزالة ectodomain من APP التي كتبها β-secretase 2. ما تبقى من 99 محطة بقايا الكربوكسيل جزء (CTF) يمكن المشقوق من قبل γ-secretase لإنتاج Aβ 3-7. بينما العديد من التجارب وقد وثقت الانقسام من سطح الخلية APP بعد استيعاب من سطح الخلية في نظام endosomal / الليزوزومية، وعدد من الدراسات الحديثة قد اقترح أن الاتجار داخل الخلايا APP مهم أيضا في تنظيم التجهيز لها 8-11.
كان هناك عدد من محاولات تحوير مستويات Aβ مع مثبطات-γ secretase وAβ إمانotherapies. ومع ذلك، أظهرت التجارب السريرية الأخيرة مع هذه العلاجات لا فائدة، وفي بعض الحالات تسبب الضرر 12. استراتيجية غير المستغلة لتعديل إنتاج Aβ هو تغيير التعريب شبه الخلوية من APP والتفاعل γ secretase. كلها قد اقترح جولجي، غشاء البلازما، والإندوسومات / الجسيمات الحالة كما غات الممكنة لγ-انشقاق من APP. البحث عن المختبر لدينا تشير إلى أن APP وγ-secretase هي البروتينات المقيمة للغشاء الليزوزومية 13. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن الليزوزومية γ-secretase لديه درجة الحموضة المثلى الحمضية 13. بالإضافة إلى ذلك، قلونة النظام endosomal / الليزوزومية مع الكلوروكين أو NH 4 الكلورين، وقد تبين أن ينخفض إنتاج Aβ 14. جاما-secretase تثبيط أو بالضربة القاضية أو Presenilin يؤدي إلى تراكم APP-كتفس في يحلول 15-17. وعلاوة على ذلك، وتعطيل APP الإلتقام يخفض Aβ إنتاج 18-20.
وعلى الرغم من أهمية جولجي كمحطة الفرز للبروتينات الوليدة والبروتينات المعاد تدويرها من النظام endosomal / الليزوزومية، لم يدرس الاتجار داخل الخلايا APP بالتفصيل 21. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة التي APP يمكن إعادة تدويرها إلى الشبكة العابرة للجولجي (TGN) عن طريق التفاعل مع مجمع retromer. تنظيم الأسفل من مجمع retromer ينخفض إنتاج Aβ 8،22-24. ومع ذلك، فإن الخروج من APP من جولجي لم يتم دراستها جيدا.
بينما بعد الإلتقام من البروتينات على سطح الخلية، مثل مستقبلات ترانسفيرين، وصفت بسهولة وتلت ذلك، في أعقاب الاتجار البروتينات داخل الخلايا هو أكثر تحديا. في الواقع، فإن القليل من البروتينات الاتجار بهم داخل الخلايا تصوير. وقد وفرت ظهور علامات بروتين فلوري، مثل الصورة activatable-GFP (paGFP)، وأدوات جديدة لدراسة الاتجار داخل الخلايا. الصور activatable-GFP هو شكل من أشكال GFP التي هي غير مرئية تقريبا بعد التوليف، ولكن تطور قوي الأخضر (GFP) مضان بعد أن تفعيلها من خلال 413 نانومتر ضوء الليزر وهذه إشارة غير مستقرة لعدة أيام 25،26. وقد استخدمت بنيات باستخدام paGFP للتدليل على الاتجار intralysosomal من البروتين الليزوزومية بروتين الغشاء 1 (LAMP1) 25، وتسليم سطح الخلية من إلتهاب الفم التقرحي الفيروسات البروتين السكري (VSVG، علامة على مسار إفرازية) 27، ودوران peroxisomes 28 وautophagosomes 29.
من أجل تصور فرز APP من TGN في الخلايا الحية، قمنا بتصميم البلازميد معربا عن مشاركة 112 الأحماض الأمينية من APP بالإضافة إلى الصور activatable (paGFP) على C-محطة (المشار إليها باسم βAPP-paGFP) 30. لقد قمنا أيضا هذه التجارب مع كامل طول APP وحققت نتائج مماثلة؛ يتم استخدام بناء ΒAPP هنا لأنها توفر صورا أكثر إشراقا. نحن بعد ذلك الصور وتفعيل# 946؛ APP-paGFP فقط في TGN، كما رسمتها TGN علامة Galactosyltransferase (جالت). على الرغم من APP تم الموسومة ب paGFP لتصور النقل محواري السريع لAPP والتخليص من منطقة محيط بالنواة، وهذا هو اول دليل على الاتجار APP من احد المقصورة محددة بعناية ل11،31،32 آخر. هنا، علينا أن نظهر دقة الصورة التنشيط داخل TGN والخروج من APP إلى أقسام المصب والانقسام اللاحق والتخليص من الجسيمات الحالة 30. في دقيقة الصور التنشيط داخل جولجي ينطبق على نطاق واسع لأنظمة البروتين الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه التقنية على دقة الصور تفعيل بروتينات غشاء الموسومة ب paGFP في TGN لتصور الاتجار والانقسام لاحق. في حين تم إنشاء paGFP أكثر من عشر سنوات 25، وهذا هو المثال الأول من دقيق الصور تفعيل لمتابعة الاتجار البروتينات الوليدة إلى حجرات المصب. الدراسات السابقة باستخدام A…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
Materials
| 35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
Riferimenti
- Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
- Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer’s amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
- De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
- Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
- Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
- Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
- Pawar, A. P., et al. Prediction of ‘aggregation-prone’ and “aggregation-susceptible. J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).
- Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer’s disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
- Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
- Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
- Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
- Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer’s disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
- Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
- Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
- Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
- Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
- Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
- Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
- Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
- Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
- Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
- Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer’s amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
- Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
- Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
- Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
- Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
- Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
- Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
- Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
- Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
- Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the ‘Swedish’ amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase”;site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
- Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
- Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
- Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
- Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).
