Imaging il traffico intracellulare di APP con GFP fotoattivabile
Summary
Mentre il trasporto delle proteine di superficie cellulare è relativamente facile studiato, visualizzare il traffico di proteine intracellulari è molto più difficile. Qui, usiamo costrutti incorporano GFP fotoattivabile e dimostrare un metodo per seguire con precisione la proteina precursore dell'amiloide dal Golgi di down-stream scomparti e seguire il suo gioco.
Abstract
Beta-amiloide (A?) È il principale costituente delle placche senili presenti nel cervello dei pazienti con malattia di Alzheimer. Ap deriva dalla scissione sequenziale di proteina precursore dell'amiloide (APP) di β-secretasi e γ. Nonostante l'importanza di Ap AD patologia, la localizzazione subcellulare di queste fratture non è ben stabilita. Lavorare nel nostro laboratorio e altri implicano il sistema endosomal / lisosomiale in processamento di APP dopo internalizzazione dalla superficie cellulare. Tuttavia, il traffico intracellulare di APP è relativamente poco studiato.
Mentre le proteine della superficie cellulare sono modificabili a molte tecniche di etichettatura, non ci sono metodi semplici per seguire il traffico di proteine di membrana del Golgi. A tal fine, abbiamo creato costrutti APP che sono stati codificati con foto-attivabile GFP (paGFP) al C-terminale. Dopo la sintesi, paGFP ha bassa fluorescenza basale, ma può essere stimolato con 413 nm luce to produrre un forte, stabile fluorescenza verde. Usando il Golgi marcatore galactosyl transferasi accoppiato ad Cyan Fluorescent Protein (GalT-PCP) come un bersaglio, siamo in grado di precisione photoactivate APP nella rete trans-Golgi. Foto-activated APP-paGFP può quindi essere seguita come traffici di scomparti a valle identificati con fluorescente tagged proteine marker vano per la precoce endosoma (Rab5), il compianto endosome (Rab9) e la lisosomi (LAMP1). Inoltre, utilizzando inibitori di processamento di APP tra cui la clorochina o γ-secretasi inibitore L685, 458, siamo in grado di effettuare esperimenti pulse-chase di esaminare il trattamento di APP in singole cellule.
Troviamo che una grande frazione di APP si sposta rapidamente alla lisosomi senza apparire sulla superficie cellulare, e viene quindi eliminato dalla lisosomi da fratture secretasi-like. Questa tecnica dimostra l'utilità della paGFP per seguire il traffico e la trasformazione delle proteine intracellulari from il Golgi compartimenti a valle.
Introduction
Il segno distintivo della malattia di Alzheimer (AD) è la presenza di placche senili e grovigli neurofibrillari (NFTS) nel cervello. Il principale costituente delle placche senili è β-amiloide (A?). Ap è derivato dal suo precursore; proteina precursore dell'amiloide (APP) 1. Il clivaggio amiloidogenica di APP inizia con la rimozione del ectodomain da APP da β-secretasi 2. Il frammento terminale carbossilico 99-residuo che rimane (CTF) può essere scisso da γ-secretasi per produrre Ap 3-7. Mentre molti esperimenti hanno documentato il clivaggio di superficie cellulare APP dopo interiorizzazione dalla superficie cellulare nel sistema endosomal / lisosomiale, numerosi studi recenti hanno suggerito che il traffico intracellulare di APP è anche importante nel regolare la sua lavorazione 8-11.
Ci sono stati un certo numero di tentativi di modulare i livelli di Ap con inibitori gamma-secretasi e A? Immunotherapies. Tuttavia, recenti studi clinici con queste terapie hanno mostrato alcun beneficio, e, in alcuni casi, ha causato danni 12. Una strategia inutilizzato ai modulare la produzione Ap è di alterare la localizzazione sub-cellulare di APP e interazione γ-secretasi. Golgi, membrana plasmatica, e endosomi / lisosomi sono stati suggeriti come possibili locali per γ-taglio di APP. Una ricerca dal nostro laboratorio suggeriscono che APP e la γ-secretasi sono proteine residenti della membrana lisosomiale 13. Inoltre, abbiamo trovato che la lisosomiali γ-secretasi ha un pH ottimale acido 13. Inoltre, alcalinizzazione del sistema endosomal / lisosomiale con clorochina o NH 4 Cl, ha dimostrato di diminuire la produzione di Ap 14. gamma-secretasi inibizione o knockout o Presenilina porta all'accumulo APP-CTFs nei lisosomi 15-17. Inoltre, interrompendo APP endocitosi abbassa produzione Ap 18-20.
Nonostante l'importanza del Golgi come stazione di smistamento per le proteine nascenti e le proteine riciclati dal sistema endosomal / lisosomiale, il traffico intracellulare di APP non è stato studiato in dettaglio 21. Studi recenti hanno dimostrato che l'APP può essere riciclato alla rete trans-Golgi (TGN) attraverso l'interazione con il complesso retromer. Regolazione Giù del complesso retromer diminuisce la produzione Ap 8,22-24. Tuttavia, l'uscita di APP dal Golgi non è stato ben studiato.
Pur seguendo l'endocitosi delle proteine di superficie cellulare, quali il recettore della transferrina, sono facilmente etichettato e seguita, dopo il traffico di proteine intracellulari è più impegnativo. In realtà, poche proteine hanno avuto il loro traffico intracellulare ripreso. L'avvento di tag proteina fluorescente, come foto-attivabili-GFP (paGFP), ha fornito nuovi strumenti per esaminare il traffico intracellulare. Foto-attivabili-GFP è una forma di GFP che è quasi invisibile dopo la sintesi, ma sviluppa forte verde (GFP) fluorescenza dopo l'attivazione da 413 nm di luce laser e questo segnale è stabile per giorni 25,26. I costrutti che utilizzano paGFP sono stati utilizzati per dimostrare il traffico intralysosomal della proteina Lysosomal proteine di membrana 1 (LAMP1) 25, la consegna superficie cellulare della stomatite virus vescicolare glicoproteina (VSVG, un marker di via secretoria) 27, e il fatturato dei perossisomi 28 e 29 autofagosomi.
Per visualizzare lo smistamento di APP dal TGN in cellule vive, abbiamo progettato plasmide esprimente ultimi 112 amminoacidi di APP accoppiati a foto-attivabile (paGFP) sul terminale C (denominato βAPP-paGFP) 30. Abbiamo anche eseguito questi esperimenti con lunghezza APP e ha raggiunto risultati simili; il costrutto ΒAPP è usata qui perché fornisce immagini più luminose. Abbiamo poi photo disattivare &# 946; APP-paGFP solo nel TGN, come delimitate dalla TGN marcatore galattosiltransferasi (GalT). Nonostante APP è stato taggato con paGFP di visualizzare un rapido trasporto assonale di APP e la clearance della regione perinucleare, questa è la prima dimostrazione di traffico di APP da un compartimento accuratamente definito ad un altro 11,31,32. Qui, dimostriamo accurata foto-attivazione entro il TGN e la fuoriuscita di APP in compartimenti a valle e la successiva scissione e liquidazione di lisosomi 30. L'accurata fotoattivazione all'interno del Golgi è ampiamente applicabile ad altri sistemi proteici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa tecnica descrive l'esatto foto-attivazione delle proteine di membrana taggati con paGFP nel TGN di visualizzare la successiva tratta e scissione. Mentre paGFP è stato creato oltre dieci anni fa 25, questo è il primo esempio di accurata foto-attivazione per seguire il traffico di proteine nascenti ai compartimenti a valle. Studi precedenti utilizzando APP-paGFP costruisce foto-attivata una regione peri-nucleare della cellula, che è stato considerato il Golgi 11. Tuttavia, c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
Materials
| 35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
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