Imaging o tráfego intracelular de APP com GFP fotoactivável
Summary
Embora o transporte de proteínas de superfície celular está relativamente facilmente estudado, visualizando o tráfico de proteínas intracelulares é muito mais difícil. Aqui, usamos construções que incorporam GFP fotoactivável e demonstrar um método para seguir com precisão a proteína precursora de amilóide do aparelho de Golgi para compartimentos a jusante e siga a sua depuração.
Abstract
Beta-amilóide (Ap) é o constituinte principal das placas senis encontradas nos cérebros de pacientes com doença de Alzheimer. Ap é derivado da clivagem sequencial da Proteína Precursora Amilóide (APP) por β e y-secretases. Apesar da importância de Ap a patologia da DA, a localização subcelular destas clivagens não está bem estabelecida. Trabalhar em nosso laboratório e outros implicam o sistema endossomal / lisossomal no processamento de APP após a internalização da superfície da célula. No entanto, o tráfego intracelular da APP é relativamente pouco estudada.
Embora as proteínas da superfície celular são alteráveis a muitas técnicas de marcação, não existem métodos simples para seguir o tráfico de proteínas de membrana a partir do Golgi. Para este fim, criada construções de APP que foram marcados com foto-activável GFP (paGFP) na extremidade C-terminal. Após a síntese, paGFP tem baixa fluorescência basal, mas pode ser estimulado com luz de 413 nm, to produzir uma fluorescência verde forte, estável. Ao utilizar o marcador de Golgi galactosiltransferase acoplados à proteína fluorescente ciano (GalT-PCP) como um alvo, que são capazes de APP com precisão fotoactivar na rede trans-Golgi. Photo-ativado APP-paGFP pode então ser seguido, uma vez que trafica para compartimentos jusante identificados com fluorescente etiquetado proteínas marcadoras compartimento para o endossomo precoce (Rab5), o falecido endosome (Rab9) e do lisossoma (LAMP1). Além disso, o uso de inibidores do processamento de APP, incluindo o inibidor de cloroquina ou L685 γ-secretase, 458, que são capazes de realizar experiências pulse-chase para examinar o processamento de APP em células individuais.
Descobrimos que uma grande fracção da APP move-se rapidamente para o lisossoma sem aparecer na superfície da célula, e é então eliminado do lisossoma por clivagens-secretase semelhantes. Esta técnica demonstra a utilidade de paGFP para seguir o tráfico e processamento de proteínas intracelulares from o Golgi para compartimentos a jusante.
Introduction
A característica da doença de Alzheimer (DA) é a presença de placas senis e emaranhados neurofibrilares (NFTs) no cérebro. O constituinte principal das placas senis é β-amilóide (Ap). Ap é derivado de seu precursor; proteína precursora de amilóide (APP) 1. A clivagem de APP amiloidog�ica começa com a remoção do ectodomínio de APP pela secretase β-2. O fragmento do terminal carboxilo de 99-resíduo remanescente (CTF) pode ser clivado pela secretase γ para produzir Ap 3-7. Enquanto muitas experiências documentaram a clivagem de APP na superfície celular após a internalização a partir da superfície da célula para o sistema endossomal / lisossomal, uma série de estudos recentes têm sugerido que o tráfico intracelular da APP também é importante na regulação da sua transformação 8-11.
Tem havido uma série de tentativas de modular os níveis de Ap com inibidores y-secretase e Ap Immunotherapies. No entanto, os ensaios clínicos recentes com essas terapias não mostrou nenhum benefício, e, em alguns casos, causaram danos 12. Uma estratégia inexplorada de modular a produção de Ap é alterar a localização sub-celular de APP e interacção γ-secretase. Os Golgi, membrana de plasma, e endosomes / lisossomos têm sido sugeridos como possíveis locais para γ-clivagem de APP. Pesquisas no nosso laboratório sugerem que a APP eo γ-secretase são proteínas residentes da membrana lisossomal 13. Além disso, verificou-se que o lisossomais γ-secretase tem um pH óptimo ácido 13. Além disso, a alcalinização do sistema endossomal / lisossomal com cloroquina ou NH4Cl, foi demonstrado para diminuir a produção de Ap 14. y-secretase inibição ou nocaute ou Presenilin leva ao acúmulo APP-CTFs no lisossoma 15-17. Além disso, interrompendo APP endocitose reduz a produção de Ap 18-20.
Apesar da importância do Golgi como uma estação de triagem para as proteínas e as proteínas reciclados a partir do sistema endossomal / lisossomal nascentes, o tráfico intracelular de APP não tem sido estudada em pormenor 21. Um trabalho recente demonstrou que a APP pode ser reciclado para a rede trans-Golgi (TGN), através de interacção com o complexo retromer. Regulação para baixo do complexo retromer diminui a produção de Ap 8,22-24. No entanto, a saída de APP a partir do Golgi, não tem sido bem estudada.
Ao seguir a endocitose de proteínas de superfície celular, tais como o receptor de transferrina, são facilmente identificados e seguidos, após o tráfico de proteínas intracelulares é mais difícil. Na verdade, poucas proteínas tiveram seu tráfego intracelular trabalhada. O advento das marcas de proteínas fluorescentes, tais como foto-activável-GFP (paGFP), tem proporcionado novas ferramentas para examinar o tráfico intracelular. Photo-activatable-GFP é uma forma de GFP que é quase invisível após a síntese, mas desenvolve verde forte (GFP) de fluorescência depois de ser ativado por 413 nm de luz laser e este sinal é estável durante dias 25,26. Constructos usando paGFP têm sido utilizados para demonstrar o tráfico intralisossomal da proteína lisossómica proteína de membrana 1 (LAMP1) 25, a entrega da superfície da célula do vírus da estomatite vesicular glicoproteína (VSVG, um marcador da via secretora) 27, e o volume de peroxissomas 28 e 29 autofagossomas.
A fim de visualizar a triagem de APP do TGN em células vivas, que concebido plasmídeo expressando os últimos 112 aminoácidos da APP acoplados a foto-activável (paGFP) no terminal C (referida como pAPP-paGFP) 30. Também realizamos esses experimentos com APP de comprimento total e alcançou resultados semelhantes; a construção pAPP é usado aqui porque fornece imagens mais brilhantes. Em seguida, foto-activate &# 946; APP-paGFP apenas no TGN, como demarcada pela TGN marcador Galactosiltransferase (GalT). Embora APP foi marcado com paGFP para visualizar o transporte axonal rápido da APP e autorização da região perinuclear, esta é a primeira demonstração de tráfico de APP de um compartimento cuidadosamente definidos para outro 11,31,32. Aqui, nós demonstramos foto-ativação exata dentro do TGN ea saída de APP em compartimentos jusante e subsequente clivagem e apuramento de lisossomos 30. A foto-activação preciso dentro do Golgi é amplamente aplicável a outros sistemas de proteínas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta técnica descreve a foto-ativação precisa de proteínas de membrana marcados com paGFP no TGN para visualizar tráfico e subsequente clivagem. Enquanto paGFP foi criada mais de uma década de 25, este é o primeiro exemplo de foto-ativação precisa de seguir o tráfico de proteínas nascentes para compartimentos jusante. Estudos anteriores utilizando APP-paGFP constrói uma região peri-nuclear da célula, a qual foi considerada o Golgi-11 activado foto. No entanto, como é evidente nas nos…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
Materials
| 35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
Riferimenti
- Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
- Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer’s amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
- De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
- Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
- Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
- Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
- Pawar, A. P., et al. Prediction of ‘aggregation-prone’ and “aggregation-susceptible. J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).
- Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer’s disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
- Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
- Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
- Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
- Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer’s disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
- Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
- Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
- Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
- Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
- Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
- Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
- Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
- Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
- Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
- Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer’s amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
- Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
- Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
- Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
- Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
- Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
- Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
- Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
- Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
- Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the ‘Swedish’ amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase”;site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
- Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
- Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
- Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
- Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).
