Imaging Intracellulär Trafficking av APP med fotoaktiverbar GFP
Summary
Medan transport av cellytproteiner är relativt lätt studeras, visualisera handeln med intracellulära proteiner är mycket svårare. Här använder vi konstruktioner innehåller fotoaktiverbara GFP och demonstrera en metod för att noggrant följa amyloidprekursorproteinet från Golgi-apparaten till nedströms fack och följer dess clearance.
Abstract
Beta-amyloid (Ap) är huvudbeståndsdelen av senila plack som har hittats i hjärnan hos patienter med Alzheimers sjukdom. Ap härrör från den sekventiella klyvning av amyloidprekursorprotein (APP) genom β och y-sekre. Trots betydelsen av Ap till AD patologi, är den subcellulära lokaliseringen av dessa klyvningar inte väl etablerad. Arbeta i vårt laboratorium och andra implicerar det endosomala / lysosomala systemet i APP bearbetning efter internalisering från cellytan. Dock är den intracellulära handel med APP relativt understudied.
Medan cell-ytproteiner är kan ändras för många märkningstekniker finns det inga enkla metoder för att följa handel med membranproteiner från Golgi. För detta ändamål har vi skapat APP konstruktioner som var märkta med foto aktiverbar GFP (paGFP) vid C-terminalen. Efter syntes, har paGFP låg basal fluorescens, men den kan stimuleras med 413 nm ljus to producera en stark, stabil grön fluorescens. Genom att använda Golgi markören galaktosyltransferas kopplad till Cyan fluorescerande protein (GalT-GFP) som ett mål, kan vi exakt photoactivate APP i trans-Golgi nätverket. Foto-aktiverad APP-paGFP kan sedan följas eftersom det trafikerar nedströms fack identifieras med fluorescerande taggade fack markörproteiner för tidig endosomen (Rab5), den sena endosomen (Rab9) och lysosomen (LAMP1). Dessutom använder inhibitorer till APP-bearbetning inklusive klorokin eller inhibitor L685 den γ-sekretas, 458, har vi möjlighet att utföra puls-chase experiment för att undersöka bearbetning av APP i enskilda celler.
Vi finner att en stor del av APP flyttar snabbt till lysosomen utan uppträder på cellytan, och försvinner sedan från lysosomen genom sekretas liknande klyvningar. Denna teknik visar nyttan av paGFP för att följa handel och bearbetning av intracellulära proteiner tillbakam Golgi till fack nedströms.
Introduction
Det kännetecknande för Alzheimers sjukdom (AD) är förekomsten av senila plack och neurofibrillära nystan (NFT) i hjärnan. Den viktigaste beståndsdelen i senila plack är β-amyloid (A-beta). Ap härrör från dess föregångare; amyloidprekursorproteinet (APP) 1. Den amyloidogena klyvningen av APP börjar med avlägsnande av ektodomänen från APP genom β-sekretas 2. De återstående 99-rest karboxylterminala fragmentet (CTF) kan klyvas av γ-sekretas att producera A-beta 3-7. Medan många experiment har dokumenterat klyvningen av cellytan APP efter internalisering från cellytan i det endosomala / lysosomala systemet har ett antal nya studier tyder på att intracellulära handel med APP är också viktigt för att reglera sin bearbetning 8-11.
Det har förekommit ett antal försök på modulera nivåerna av Ap med y-sekretas hämmare och Ap Immunotherapies. Den senaste tidens kliniska prövningar med dessa behandlingar visade ingen nytta, och i vissa fall, orsakat skada 12. En outnyttjad strategi för att modulera Ap produktion är att ändra sub-cellulära lokaliseringen av APP och γ-sekretas interaktion. Golgi, plasmamembran, och endosomer / lysosomer har alla föreslagits som möjliga lokaler för γ-klyvning av APP. Undersökningar i vår laboratorium visar att APP och γ-sekretas är bosatta proteiner av det lysosomala membranet 13. Vidare har vi funnit att det lysosomala γ-sekretas har ett surt optimalt pH 13. Dessutom alkalisering av endosomal / lysosomala systemet med klorokin eller NH4CI, har visat sig minska produktionen av Ap 14. y-sekretas hämning eller knockout eller Presenilin leder till APP-CTFs ackumulering i lysosomen 15-17. Dessutom stör APP endocytos sänker Ap produktion 18-20.
Trots betydelsen av Golgi som en sorteringsstation för begynnande proteiner och proteiner återvinns från endosomala / lysosomala systemet har den intracellulära handel med APP inte studerats i detalj 21. Senaste arbete har visat att APP kan återföras till det trans Golgi nät (TGN) via interaktion med retromer komplexet. Nedreglering av retromer komplexet minskar Ap produktion 8,22-24. Men utträde av APP från Golgi har inte studerats.
Medan efter endocytos av cell ytproteiner, såsom transferrinreceptorn är lätt märks och följs, efter handeln med intracellulära proteiner är mer utmanande. I själva verket har få proteiner hade deras intracellulära handel avbildas. Tillkomsten av fluorescerande protein taggar, såsom foto aktiveras-GFP (paGFP), har gett nya verktyg för att undersöka intracellulära människohandel. Foto-aktiverbar-GFP är en form av GFP som är nästan osynlig efter syntes, men utvecklar en stark grön (GFP) fluorescens efter att ha blivit aktiverad av 413 nm laserljus och denna signal är stabil under dagar 25,26. Konstruktioner använder paGFP har använts för att demonstrera intralysosomal handel av lysosomalt protein membranprotein 1 (LAMP1) 25, cellytan leverans av vesikulärt stomatitvirus glykoprotein (VSVG, en markör för den sekretoriska vägen) 27, och omsättningen av peroxisomer 28 och autophagosomes 29.
För att visualisera sortering av APP från TGN i levande celler, utformade vi plasmid som uttrycker de sista 112 aminosyrorna av APP kopplade till foto aktiveras (paGFP) på C-terminalen (benämnd PAPP-paGFP) 30. Vi har också utfört dessa experiment med full längd APP och uppnått liknande resultat; PAPP konstruktionen används här eftersom det ger ljusare bilder. Vi sedan foto aktivera &# 946; APP-paGFP bara i TGN, som avgränsas av TGN markören galaktosyltransferaset (GalT). Även om APP har märkts med paGFP att visualisera snabb axonal transport av APP och godkännande från den perinukleära regionen, är detta den första demonstrationen av APP människohandel från ett noggrant definierade utrymmet till en annan 11,31,32. Här visar vi exakt fotoaktivering i TGN och utträde av APP till nedströms fack och efterföljande klyvning och klartecken från lysosomer 30. Den exakta fotoaktivering i Golgi är allmänt gäller för andra proteinsystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna teknik beskriver exakt foto aktivering av membranproteiner taggade med paGFP i TGN att visualisera efterföljande handel och klyvning. Medan paGFP skapades över ett decennium sedan 25, är detta det första exemplet på exakt fotoaktivering att följa handel med begynnande proteiner till fack nedströms. Tidigare studier med APP-paGFP konstruerar foto aktiverat en peri-nukleär region i cellen, som ansågs vara Golgi 11. Men, kan så tydligt i våra mikrografer, lysosomer, tidiga endosomer, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
Materials
| 35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
Riferimenti
- Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
- Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer’s amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
- De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
- Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
- Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
- Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
- Pawar, A. P., et al. Prediction of ‘aggregation-prone’ and “aggregation-susceptible. J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).
- Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer’s disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
- Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
- Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
- Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
- Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer’s disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
- Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
- Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
- Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
- Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
- Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
- Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
- Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
- Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
- Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
- Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer’s amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
- Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
- Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
- Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
- Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
- Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
- Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
- Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
- Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
- Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the ‘Swedish’ amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase”;site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
- Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
- Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
- Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
- Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).
