Photoactivatable GFP के साथ एपीपी के intracellular तस्करी इमेजिंग

Summary

कोशिका की सतह प्रोटीन के परिवहन अपेक्षाकृत आसानी से अध्ययन किया है, वहीं इंट्रासेल्युलर प्रोटीन की तस्करी visualizing और अधिक कठिन है। यहाँ, हम photoactivatable GFP को शामिल निर्माणों का उपयोग करें और सही ढंग से डाउन स्ट्रीम डिब्बों को गॉल्जी उपकरण से amyloid अग्रदूत साबित प्रोटीन का पालन करें और इसकी मंजूरी का पालन करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन।

Abstract

बीटा amyloid (Aβ) अल्जाइमर रोग के मरीजों के दिमाग में पाया बूढ़ा सजीले टुकड़े के प्रमुख घटक है। Aβ β और γ-secretases द्वारा Amyloid अग्रदूत साबित प्रोटीन (एपीपी) के अनुक्रमिक दरार से ली गई है। ई विकृति को Aβ के महत्व के बावजूद, इन चोली के subcellular स्थानीयकरण अच्छी तरह से स्थापित नहीं किया गया है। हमारी प्रयोगशाला में काम करते हैं और दूसरों की कोशिका की सतह से internalization के बाद एप्लिकेशन प्रसंस्करण में endosomal / लाइसोसोमल सिस्टम फंसाना। हालांकि, एपीपी के intracellular की तस्करी अपेक्षाकृत understudied है।

सेल सतह प्रोटीन कई लेबलिंग तकनीक को सुधारने योग्य हैं, वहीं गॉल्जी से झिल्ली प्रोटीन की तस्करी निम्नलिखित के लिए कोई आसान तरीके हैं। यह अंत करने के लिए, हम सी टर्मिनस पर फोटो सक्रिय GFP (paGFP) के साथ टैग कर रहे थे कि एपीपी निर्माणों बनाया। संश्लेषण के बाद, paGFP कम बेसल प्रतिदीप्ति है, लेकिन यह 413 एनएम प्रकाश टी के साथ प्रेरित किया जा सकताओ एक मजबूत, स्थिर हरी प्रतिदीप्ति का उत्पादन। का उपयोग करके गॉल्जी मार्कर galactosyl ट्रांस्फ़्रेज़ एक लक्ष्य के रूप में सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (Galt-सीएफपी) के लिए मिलकर, हम पार गॉल्जी नेटवर्क में सही photoactivate एपीपी करने में सक्षम हैं। यह fluorescently के साथ की पहचान बहाव के डिब्बों को traffics जल्दी इंडो सोम (Rab5), देर इंडो सोम (Rab9) और लाइसोसोम (LAMP1) के लिए डिब्बे मार्कर टैग प्रोटीन के रूप में फोटो सक्रिय एपीपी-paGFP तो पीछा किया जा सकता है। इसके अलावा, क्लोरोक्वीन या γ-secretase अवरोध करनेवाला L685, 458 सहित एपीपी प्रसंस्करण के लिए अवरोधकों का उपयोग करते हुए, हम एकल कक्षों में एपीपी के प्रसंस्करण की जांच के लिए पल्स-चेस प्रयोगों प्रदर्शन करने में सक्षम हैं।

हम app का एक बड़ा अंश कोशिका की सतह पर दिखने के बिना लाइसोसोम के लिए तेजी से चलता है, और उसके बाद secretase-जैसे चोली द्वारा लाइसोसोम से मंजूरी दे दी है कि लगता है। इस तकनीक fro intracellular प्रोटीन की तस्करी और प्रसंस्करण निम्नलिखित के लिए paGFP की उपयोगिता को दर्शाता हैबहाव के डिब्बों को गॉल्जी हूँ।

Introduction

अल्जाइमर रोग (ई) की बानगी बूढ़ा सजीले टुकड़े और मस्तिष्क में न्यूरोफ्रिब्रिल्लरी उलझनों (NFTs) की उपस्थिति है। बूढ़ा सजीले टुकड़े के प्रमुख घटक β-amyloid (Aβ) है। Aβ उसके अग्रदूत से प्राप्त होता है; amyloid अग्रदूत साबित प्रोटीन (एपीपी) ^1। एपीपी के amyloidogenic दरार β-secretase ² से एपीपी से ectodomain को हटाने के साथ शुरू होता है। शेष 99-अवशेषों कार्बाक्सिल टर्मिनल टुकड़ा (CTF) Aβ ^3-7 उत्पादन करने के लिए γ-secretase द्वारा cleaved जा सकता है। कई प्रयोगों endosomal / लाइसोसोमल प्रणाली में कोशिका की सतह से internalization के बाद कोशिका की सतह एपीपी की दरार दस्तावेज है, वहीं हाल ही के अध्ययन के एक नंबर एपीपी के intracellular तस्करी भी इसके प्रसंस्करण ^8-11 विनियमित करने में महत्वपूर्ण है कि सुझाव दिया है।

Γ-secretase अवरोधकों और Aβ Immun साथ Aβ के स्तर को नियमन करने के प्रयास के एक नंबर दिया गया हैotherapies। हालांकि, इन उपचारों के साथ हाल ही में क्लिनिकल परीक्षण के कुछ मामलों में, नुकसान ¹² के कारण होता है, कोई लाभ नहीं दिखाया है, और। Aβ उत्पादन व्यवस्थित करना एक unexploited रणनीति एपीपी के उप सेलुलर स्थानीयकरण और γ-secretase बातचीत को बदलने के लिए है। गॉल्जी, प्लाज्मा झिल्ली, और endosomes / लाइसोसोम सभी एप्लिकेशन की γ-दरार के लिए संभव स्थानों के रूप में सुझाव दिया गया है। हमारी प्रयोगशाला से अनुसंधान एपीपी और γ-secretase लाइसोसोमल झिल्ली ¹³ के निवासी प्रोटीन होते हैं कि पता चलता है। इसके अलावा, हम लाइसोसोमल γ-secretase एक अम्लीय इष्टतम पीएच ¹³ है कि मिल गया है। इसके अलावा, क्लोरोक्वीन या एनएच ₄ सीएल साथ endosomal / लाइसोसोमल प्रणाली के क्षारीय, Aβ ¹⁴ के उत्पादन में कमी दर्ज की गई है। -γ secretase निषेध या पीटकर या Presenilin लाइसोसोम ^15-17 में एपीपी-CTFs संचय की ओर जाता है। इसके अलावा, एपीपी endocytosis में खलल न डालें Aβ उत्पादन ^18-20 को कम करती है।

नवजात प्रोटीन और endosomal / लाइसोसोमल सिस्टम से पुनर्नवीनीकरण प्रोटीन के लिए एक छँटाई स्टेशन के रूप में गॉल्जी के महत्व के बावजूद, एपीपी के intracellular की तस्करी विस्तार ²¹ में अध्ययन नहीं किया गया। हाल ही में काम एपीपी retromer परिसर के साथ बातचीत के माध्यम से पार गॉल्जी नेटवर्क (TGN) को साफ किया जा सकता है कि दिखाया गया है। Retromer परिसर के नीचे विनियमन Aβ उत्पादन ^8,22-24 कम हो जाती है। हालांकि, गॉल्जी से एपीपी के निकास अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है।

ऐसे transferrin रिसेप्टर के रूप में सेल सतह प्रोटीन की endocytosis का पालन करते हुए, आसानी से लेबल और पीछा कर रहे हैं, इंट्रासेल्युलर प्रोटीन की तस्करी निम्नलिखित अधिक चुनौतीपूर्ण है। वास्तव में, कुछ प्रोटीन उनके intracellular की तस्करी imaged पड़ा है। ऐसे फोटो-सक्रिय-GFP (paGFP), के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग के आगमन इंट्रासेल्युलर की तस्करी की जांच करने के लिए नए उपकरण उपलब्ध कराया गया है। फोटो-सक्रिय-GFP GF का एक रूप हैसंश्लेषण के बाद लगभग अदृश्य है, लेकिन 413 एनएम लेजर प्रकाश से सक्रिय होने के बाद मजबूत हरी (GFP) के प्रतिदीप्ति विकसित करता है और यह संकेत दिनों ^25,26 के लिए स्थिर है कि पी। PaGFP का उपयोग करते हुए निर्माणों lysosomal प्रोटीन की intralysosomal की तस्करी प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है झिल्ली प्रोटीन 1 (LAMP1) ^25, vesicular stomatitis वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (VSVG, स्रावी मार्ग के एक ^{मार्कर), 27} की कोशिका की सतह से वितरण, और peroxisomes का कारोबार ²⁸ और ²⁹ autophagosomes।

जीवित कोशिकाओं में TGN से एपीपी की छंटाई कल्पना करने के क्रम में, हम सी टर्मिनल पर तस्वीर-सक्रिय (paGFP) के लिए मिलकर एपीपी के अंतिम 112 अमीनो एसिड व्यक्त प्लाज्मिड के लिए बनाया गया ³⁰ (βAPP-paGFP के रूप में करने के लिए कहा गया है)। हम भी पूरी लंबाई एपीपी के साथ इन प्रयोगों का प्रदर्शन और इसी तरह के परिणाम प्राप्त कर ली है; यह उज्जवल चित्र प्रदान करता है क्योंकि ΒAPP का निर्माण यहां इस्तेमाल किया जाता है। हम तो तस्वीर सक्रिय &# 946; केवल TGN में एपीपी-paGFP, TGN मार्कर Galactosyltransferase (Galt) द्वारा सीमांकन के रूप में। एपीपी perinuclear क्षेत्र से तेजी से axonal एपीपी के परिवहन और निकासी कल्पना करने के लिए paGFP के साथ टैग किया गया है, यह एक सावधानी से परिभाषित डिब्बे से एक और ^11,31,32 के लिए एपीपी की तस्करी का पहला प्रदर्शन है। यहाँ, हम सटीक TGN भीतर तस्वीर-सक्रियण और नीचे की ओर डिब्बों और लाइसोसोम ³⁰ से बाद में दरार और निकासी में एपीपी के निकास प्रदर्शित करता है। गॉल्जी के भीतर सही तस्वीर-सक्रियण अन्य प्रोटीन प्रणालियों के लिए व्यापक रूप से लागू होता है।

Protocol

1. सेल चढ़ाना और अभिकर्मक एक सेल संस्कृति हुड में, प्लेट ~ 300,000 से ~ 500,000 SN56 कोशिकाओं (डॉ जेन Rylett का एक तरह का उपहार) एक 35 मिमी गिलास नीचे कोंफोकल पकवान पर और (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, DMEM, साथ पूरक पूर्व अभिकर्मक मी?…

Representative Results

ठेठ परिणाम βAPP (और चित्रा 1 ए ख) TGN जा रही है और तेजी से LAMP1 को यातायात के लिए प्रकट होता दिखा। तस्वीर-सक्रियण अवधि के दौरान, पुटिकाओं लाइसोसोम (चित्रा 1 बी) के लिए किस्मत गॉल्जी प्रस्थान देखा जा सक?…

Discussion

इस तकनीक को बाद में तस्करी और दरार कल्पना करने के लिए TGN में paGFP के साथ टैग झिल्ली प्रोटीन की सही तस्वीर-सक्रियण वर्णन करता है। PaGFP ²⁵ एक दशक पहले बनाया गया था, वहीं इस बहाव के डिब्बों को नवजात प्रोटीन की त?…

Materials

35-mm glass bottom culture dishes	Matek	P-35G-1.5-20-C
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14190-144
Hanks Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-092
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11995-092
Penicilin/Streptomycin	Life Technologies	15140-122
dibutyrl cyclic AMP	Sigma	D0627
Heat in activated Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10082147
Heated Microscopy stage insert P	PeCon GmbH
Tempcontrol 37–2 digital 2-channel	PeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope	Carl Zeiss		with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser
Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens	Carl Zeiss
L685, 458	EMD Millipore	565771	dissolved in DMSO
cholorquine	Sigma	C6628	dissolved in water
Nocodazole	Sigma	M1404	dissolved in DMSO
Dimethyl sulphoxide	Sigma	472301
Imaris	Bitplane		with colocalization package