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Articolo metodologico

Imaging il traffico intracellulare di APP con GFP fotoattivabile

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DOI:

10.3791/53153

⸱

17 ottobre 2015

 , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Robarts Research Institute, Western University, 2Department of Clinical Neurological Sciences, Western University

In questo articolo

Sommario

Mentre il trasporto delle proteine ​​di superficie cellulare è relativamente facile studiato, visualizzare il traffico di proteine ​​intracellulari è molto più difficile. Qui, usiamo costrutti incorporano GFP fotoattivabile e dimostrare un metodo per seguire con precisione la proteina precursore dell'amiloide dal Golgi di down-stream scomparti e seguire il suo gioco.

Abstract

Beta-amiloide (A?) È il principale costituente delle placche senili presenti nel cervello dei pazienti con malattia di Alzheimer. Ap deriva dalla scissione sequenziale di proteina precursore dell'amiloide (APP) di β-secretasi e γ. Nonostante l'importanza di Ap AD patologia, la localizzazione subcellulare di queste fratture non è ben stabilita. Lavorare nel nostro laboratorio e altri implicano il sistema endosomal / lisosomiale in processamento di APP dopo internalizzazione dalla superficie cellulare. Tuttavia, il traffico intracellulare di APP è relativamente poco studiato.

Mentre le proteine ​​della superficie cellulare sono modificabili a molte tecniche di etichettatura, non ci sono metodi semplici per seguire il traffico di proteine ​​di membrana del Golgi. A tal fine, abbiamo creato costrutti APP che sono stati codificati con foto-attivabile GFP (paGFP) al C-terminale. Dopo la sintesi, paGFP ha bassa fluorescenza basale, ma può essere stimolato con 413 nm luce to produrre un forte, stabile fluorescenza verde. Usando il Golgi marcatore galactosyl transferasi accoppiato ad Cyan Fluorescent Protein (GalT-PCP) come un bersaglio, siamo in grado di precisione photoactivate APP nella rete trans-Golgi. Foto-activated APP-paGFP può quindi essere seguita come traffici di scomparti a valle identificati con fluorescente tagged proteine ​​marker vano per la precoce endosoma (Rab5), il compianto endosome (Rab9) e la lisosomi (LAMP1). Inoltre, utilizzando inibitori di processamento di APP tra cui la clorochina o γ-secretasi inibitore L685, 458, siamo in grado di effettuare esperimenti pulse-chase di esaminare il trattamento di APP in singole cellule.

Troviamo che una grande frazione di APP si sposta rapidamente alla lisosomi senza apparire sulla superficie cellulare, e viene quindi eliminato dalla lisosomi da fratture secretasi-like. Questa tecnica dimostra l'utilità della paGFP per seguire il traffico e la trasformazione delle proteine ​​intracellulari from il Golgi compartimenti a valle.

Introduzione

Il segno distintivo della malattia di Alzheimer (AD) è la presenza di placche senili e grovigli neurofibrillari (NFTS) nel cervello. Il principale costituente delle placche senili è β-amiloide (A?). Ap è derivato dal suo precursore; proteina precursore dell'amiloide (APP) 1. Il clivaggio amiloidogenica di APP inizia con la rimozione del ectodomain da APP da β-secretasi 2. Il frammento terminale carbossilico 99-residuo che rimane (CTF) può essere scisso da γ-secretasi per produrre Ap 3-7. Mentre molti esperimenti hanno documentato il clivaggio di superficie cellulare APP dopo interiorizzazione dalla superficie cellulare nel sistema endosomal / lisosomiale, numerosi studi recenti hanno suggerito che il traffico intracellulare di APP è anche importante nel regolare la sua lavorazione 8-11.

Ci sono stati un certo numero di tentativi di modulare i livelli di Ap con inibitori gamma-secretasi e A? Immunotherapies. Tuttavia, recenti studi clinici con queste terapie hanno mostrato alcun beneficio, e, in alcuni casi, ha causato danni 12. Una strategia inutilizzato ai modulare la produzione Ap è di alterare la localizzazione sub-cellulare di APP e interazione γ-secretasi. Golgi, membrana plasmatica, e endosomi / lisosomi sono stati suggeriti come possibili locali per γ-taglio di APP. Una ricerca dal nostro laboratorio suggeriscono che APP e la γ-secretasi sono proteine ​​residenti della membrana lisosomiale 13. Inoltre, abbiamo trovato che la lisosomiali γ-secretasi ha un pH ottimale acido 13. Inoltre, alcalinizzazione del sistema endosomal / lisosomiale con clorochina o NH 4 Cl, ha dimostrato di diminuire la produzione di Ap 14. gamma-secretasi inibizione o knockout o Presenilina porta all'accumulo APP-CTFs nei lisosomi 15-17. Inoltre, interrompendo APP endocitosi abbassa produzione Ap 18-20.

Nonostante l'importanza del Golgi come stazione di smistamento per le proteine ​​nascenti e le proteine ​​riciclati dal sistema endosomal / lisosomiale, il traffico intracellulare di APP non è stato studiato in dettaglio 21. Studi recenti hanno dimostrato che l'APP può essere riciclato alla rete trans-Golgi (TGN) attraverso l'interazione con il complesso retromer. Regolazione Giù del complesso retromer diminuisce la produzione Ap 8,22-24. Tuttavia, l'uscita di APP dal Golgi non è stato ben studiato.

Pur seguendo l'endocitosi delle proteine ​​di superficie cellulare, quali il recettore della transferrina, sono facilmente etichettato e seguita, dopo il traffico di proteine ​​intracellulari è più impegnativo. In realtà, poche proteine ​​hanno avuto il loro traffico intracellulare ripreso. L'avvento di tag proteina fluorescente, come foto-attivabili-GFP (paGFP), ha fornito nuovi strumenti per esaminare il traffico intracellulare. Foto-attivabili-GFP è una forma di GFP che è quasi invisibile dopo la sintesi, ma sviluppa forte verde (GFP) fluorescenza dopo l'attivazione da 413 nm di luce laser e questo segnale è stabile per giorni 25,26. I costrutti che utilizzano paGFP sono stati utilizzati per dimostrare il traffico intralysosomal della proteina Lysosomal proteine ​​di membrana 1 (LAMP1) 25, la consegna superficie cellulare della stomatite virus vescicolare glicoproteina (VSVG, un marker di via secretoria) 27, e il fatturato dei perossisomi 28 e 29 autofagosomi.

Per visualizzare lo smistamento di APP dal TGN in cellule vive, abbiamo progettato plasmide esprimente ultimi 112 amminoacidi di APP accoppiati a foto-attivabile (paGFP) sul terminale C (denominato βAPP-paGFP) 30. Abbiamo anche eseguito questi esperimenti con lunghezza APP e ha raggiunto risultati simili; il costrutto ΒAPP è usata qui perché fornisce immagini più luminose. Abbiamo poi photo disattivare &# 946; APP-paGFP solo nel TGN, come delimitate dalla TGN marcatore galattosiltransferasi (GalT). Nonostante APP è stato taggato con paGFP di visualizzare un rapido trasporto assonale di APP e la clearance della regione perinucleare, questa è la prima dimostrazione di traffico di APP da un compartimento accuratamente definito ad un altro 11,31,32. Qui, dimostriamo accurata foto-attivazione entro il TGN e la fuoriuscita di APP in compartimenti a valle e la successiva scissione e liquidazione di lisosomi 30. L'accurata fotoattivazione all'interno del Golgi è ampiamente applicabile ad altri sistemi proteici.

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Protocollo

1. cella di placcatura e trasfezione

  1. In una cappa di coltura cellulare, piatto ~ 300.000 ~ 500.000 SN56 cellule (un gentile dono del Dr. Jane Rylett) su un piatto di confocale fondo di vetro a 35 mm e coprire con i media pre-trasfezione (Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM, integrato con 10% FBS).
  2. Incubare le cellule notte a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% a proliferare.
    Nota: Le cellule devono essere circa il 50% -70% confluenti prima trasfezione.
  3. In una cappa di coltura cellulare, le cellule trasfezione con plasmidi che esprimono una proteina fluorescente taggati TGN marcatore (galactosyl transferasi accoppiato ad Cyan Fluorescent Protein, GalT-PCP), una proteina fluorescente tag marcatore vano (qui, lisosomi associato membrana proteina 1, LAMP1, con etichetta MRFP), e la proteina di interesse taggati con paGFP (βAPP-paGFP). (Questi costrutti sono stati precedentemente descritti 30)
  4. Incubare le cellule con il reagente di trasfezione e plasmide DNA fo 24 ore a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Utilizzare un rapporto di ~ 2 mg di DNA a 5 ml di agente trasfezione (ad es Lipofectamine 2000) al meglio citotossicità equilibrio ed efficienza di trasfezione. Le concentrazioni reali possono avere bisogno di essere ottimizzato per diverse plasmidi. Negli esperimenti qui descritti, utilizzare 1 mg / piatto confocale di βAPP-paGFP, 0.3 mg / piatto confocale di LAMPADA1-MRFP, e 0,2 mg / piatto confocale di Galt-PCP.
    Nota: La quantità di plasmide usato dipenderà l'efficienza di trasfezione.
  5. Per le linee di cellule neuronali: Dopo il punto 1.4, in una cappa di coltura cellulare, rimuovere i supporti pre-trasfezione e differenziare le cellule SN56 a 2 ml di DMEM integrato con 0,1% di penicillina / streptomicina con 1 mM dibutirril AMP ciclico (dbcAMP) per 24 ore.

2. Microscopio fase di preparazione

  1. Preriscaldare PBS (PBS) e soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 37 ° C. Warm-up palco microscopio prima imaging a 37 ° C.
  2. Lavare le cellule due volte con PBS, per rimuovere i media differenziazione e sostituirli con 2 ml di HBSS a 37 ° C. Cellule posto sul palco microscopio riscaldato a 37 ° C.
    Nota: Le cellule sono vitali per circa 1,5-2 ore in HBSS.
  3. Lasciare 5-10 min per la temperatura della piastra confocale per equilibrare con palco microscopio.

3. fotoattivazione di ROI sulla Golgi

  1. Con l'oculare del microscopio, trovare cellule trasfettate con GalT-CFP, LAMP1-MRFP, e βAPP-paGFP.
    1. Utilizzare un obiettivo ad immersione in olio con alto ingrandimento (es 63X o 100X). Per la conformazione visiva della fluorescenza, utilizzare un filtro impostato in grado di visualizzare FITC (per PCP e fluorescenza GFP) e rodamina (per MRFP fluorescenza).
  2. Impostare la fetta confocale per ogni canale a 1 micron. Prendete una immagine a bassa risoluzione.
  3. Ritaglia immagine solo la cella di interesse.
  4. Usando la manopola di regolazione, impostare manualmenteil piano focale al centro della cella. Questo è tipicamente la parte della cellula dove il nucleo è il più grande.
  5. Pareggio 3-5 Regioni circolari di Interesse (ROI) all'interno del TGN (GalT-PCP fluorescenza).
    1. Per disegnare ROI (cioè nel programma Zeiss LSM), selezionare il pulsante 'Modifica ROI' nella console di comando.
    2. Selezionare il pulsante ROI circolare.
    3. Fare clic e trascinare su GalT-CFP regioni positivi della cellula.
      Nota: I pacchetti foto-sbiancanti per molti microscopi hanno questa capacità.
  6. Prendete l'immagine della cella con sovrapposto ROI. Salvare una copia del ROI per riferimento futuro.
    1. Per salvare il ROI per l'immagine, selezionare il pulsante 'Macro'.
    2. Premere il pulsante 'Carica' per avviare il 'CopyRoisToOverlay' (percorso del file: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb).
      Nota: Un microscopio confocale dotato di 475-525 nm (PCP) banda passante (BP), un 500-530 nm BP (GFP),e sono tenuti a 560 nm passaggio lungo (LP) set di filtri. È inoltre necessario un laser argon 458 nm e 488 nm di emissione e un laser HeNe per l'emissione a 540 nm.
  7. Set-up il microscopio per un corso a tempo candeggina.
    1. Impostare il diodo laser (25 mW 405 nm laser) alla massima potenza.
      Attenzione: Eccessiva foto-attivazione potrebbe portare a foto-tossicità o danni alle membrane cellulari. Usare occhiali di protezione per evitare danni alla retina.
    2. Set-up del microscopio per 120 cicli di imaging.
      Nota: Un ciclo di imaging consiste di sbiancamento all'interno del ROI e l'imaging di tutta la cellula. Si tratta di un corso a tempo candeggina.
    3. Impostare il microscopio per candeggina (foto disattivare) solo il ROI per 20-30 iterazioni dopo ogni immagine. Il tempo di immagine e candeggina un'immagine varierà. Impostare un tempo di ritardo tra le immagini in modo che ogni ciclo è di circa 30 secondi.
      Nota: La parte di imaging di ogni ciclo dura circa 15-30 secondi a seconda della dimensione dell'immagine. Lo sbiancamento per ogni ROI è circa 50 msec. Bleaching dei 4 ROI per 20 iterazioni avrà 4 secondi alla fine di ogni ciclo di candeggiante / immagine.
  8. Inizia il periodo di tempo di candeggina.
  9. Spegnere il candeggio dopo 15 min (30 cicli di imaging e sbiancamento), ma continuare ad acquisire foto della cellula.
    Nota: Il tempo da 0 a 15 min è il periodo di 'impulso'.
  10. Continuare ad acquisire foto per 45 min (senza sbiancamento), a seguire la clearance di βAPP-paGFP.
    Nota: Il tempo 15 a 45 minuti è il periodo di 'caccia'.
  11. Utilizzando il metodo di analisi descritto al punto 6, co-localizzare la proteina di interesse (qui, βAPP-paGFP) con il vano di interesse (qui, LAMP1-MRFP) facendo superfici a ciascun canale.

4. Determinare il Comparto Downstream

  1. Per determinare se lisosomi (in questi esperimenti) sono compartimento finale, aggiungere inibitori della proteasi di membrana permeabile a causare proteine ​​si accumulano nei lisosomi.
    1. Per βAPP, utilizzare 0,5 micron L685, 458 (inibitore specifico γ-secretasi) durante la notte o 100 micron clorochina (deacidifies lisosomi) per 30 minuti prima di imaging.
  2. Trova cellule e photoactivate come nel passaggio 3,1-3,8.
  3. Immagine della cella per un ulteriore 45 min (senza foto-attivazione) per determinare dove βAPP-paGFP accumula in assenza di scissione.
  4. Analizzare la consegna di proteine ​​per lisosomi (o altro vano a valle) e successiva liquidazione secondo il metodo descritto al punto 6.

5. assicurare l'accuratezza della foto-attivazione entro il Golgi

  1. Warm-up HBSS a 37 ° C.
  2. Preparare una soluzione al 2 ml, per ogni piatto confocale a essere ripreso, di 66 micron nocodazole (trattamento) o DMSO (controllo) in HBSS.
    1. Per un piatto confocale, pipetta 2 ml di 37 ° C HBSS e aggiungere 7,96 ml di nocodazole da un nocodazole magazzino 16.60 mm.
    2. Come controllo cosìluzione, pipetta 2 ml di 37 ° C in una provetta HBSS 2 ml e aggiungere 7,96 ml di DMSO.
  3. Incubare cellule in HBSS con nocodazole o DMSO per 5 minuti prima di imaging.
  4. Trova le cellule come al punto 3.1.
  5. Prima fotoattivazione, preparare il microscopio per prendere un Z-stack dopo il periodo di fotoattivazione.
    1. Fare clic sul pulsante 'Z Stack'. Avviare la scansione utilizzando XY veloce.
    2. Regolare il piano focale con la manopola di regolazione microscopio per la parte superiore della cella. Premere 'Mark First' per impostare la prima posizione nella pila.
    3. Regolare il piano focale con la manopola di regolazione del microscopio al fondo (più vicino al vetro) della cella. Premere 'Mark Ultimo' per impostare l'ultima posizione nella pila.
    4. Nel pannello pila Z, premere il tasto 'Z sezionamento'. Impostare l''intervallo' a 1 micron.
      Nota: per una risoluzione spaziale più alta pila un intervallo più piccola pila, ma altre immagini dovrannoadottare allungando il periodo di imaging per lo stack.
  6. Bleach le cellule, come descritto al punto 3.7-3.8. Foto-activate e immagini da 0 min a 15 min (30 fotogrammi).
  7. Smettere di imaging dopo 30 fotogrammi. Immediatamente salvare un'immagine del video.
    Attenzione: alcuni microscopi possono sovrascrivere primo video se non viene salvato prima di iniziare una seconda sequenza di imaging.
  8. Dopo aver salvato il video, acquisire immediatamente un Z-stack, utilizzando i parametri dal punto 5.5.
  9. Co-localizzare βAPP-paGFP con GalT-CFP (o altro marcatore Golgi), come descritto al punto 6.
    Nota: CFP photobleaches rapidamente e possono non essere visibili dalla fine del periodo di imaging. Colocalization potrebbe non essere possibile con GalT-PCP. Se è necessaria una co-localizzazione, utilizzare MRFP di tag GalT.

6. Filtraggio vescicole e Colocalizzazione

  1. Utilizzare un programma di analisi (es Imaris) per rendere le superfici del vano (ad esempio LAMP1-MRFP) e una proteina ointeresse f (ad es βAPP-paGFP).
  2. Entra nella sezione 'Surpass' del programma di analisi facendo clic sul pulsante Surpass sulla barra dei menu in alto.
  3. Selezionare il pulsante wizard di superficie nella parte superiore del pannello di sinistra più (5 ° pulsante da sinistra).
  4. Selezionare il canale da filtrare vescicole (cioè βAPP-paGFP fluorescenza, proteina di interesse).
  5. Eseguire sfondo sottrazione presentando il diametro del più grande vescicole in campo per la procedura guidata e premere avanti. Il programma di analisi seleziona automaticamente - sulla base di una soglia derivato dal grande vescicole nel campo - un'area nel canale di interesse.
    1. Regolare manualmente lo sfondo di soglia per rifinire la selezione, se necessario.
  6. Nella parte inferiore della schermata di selezione della soglia, selezionare l'opzione 'toccare oggetti Split "per separare il combinato superfici.
    Nota: Se molti vescicole sono strettamente raggruppati persieme, il programma di analisi volontà gruppo questi oggetti in una superficie.
    1. Scegli 10-15 vescicole rappresentativi e calcolare il diametro medio delle vescicole e inserire il risultato nella procedura guidata.
  7. Perfezionare i punti seme selezionati aumentando o diminuendo la soglia su 'Quality' (intensità del canale al centro di ogni spot).
    Verrà creato superfici del canale di interesse: Nota. Ulteriore affinamento delle superfici selezionate può essere eseguita in questo punto. Vescicole soglia in base al numero di pixel in ciascun vescicole.
  8. Mascherare il canale originale con questa superficie. Per mascherare, selezionare la scheda 4 ° da sinistra nella procedura guidata di creazione di superfici (matita).
  9. Seleziona 'mascherare tutti'. Verrà creato un nuovo canale con le vescicole di interesse.
    Nota: Durante il processo di maschera, la possibilità di duplicare il canale originale viene offerto. Selezionare questa opzione se i dati originali deve essere salvato.
  10. Ripetere steps 6.1 tramite 6.7 per il canale non filtrato (cioè LAMP1 MRFP, vano).
  11. Alla barra degli strumenti in alto, selezionare lo strumento colocalizzazione.
    1. Nel pannello superiore, come appaiono gli istogrammi dei canali da colocalized, selezionare i canali mascherati recente creazione.
    2. Selezionare tutti i dati disponibili. Ci sono pixel scuri che a volte sono presenti dopo l'analisi. Non selezionare questi pixel nell'istogramma, saranno falsare i risultati.
    3. Nel pannello a destra, selezionare 'Crea Coloc Channel'. Questo crea un nuovo canale che contiene solo i pixel colocalized. I dati saranno nello stesso pannello sotto il pulsante 'Statistiche Channel'. I dati possono essere esportati come file CSV.
    4. Utilizzare la statistica 'Percentuale di materiale colocalizzava'. Questa opzione tiene conto dell'intensità dei pixel e le dimensioni dell'oggetto.

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Risultati

I risultati tipici mostrano βAPP lasciando TGN e sembra traffico rapidamente LAMP1 (Figura 1a e b). Durante il periodo di fotoattivazione, vescicole possono essere visti in partenza Golgi destinato lisosomi (Figura 1b). Senza trattamento inibitore, paGFP fluorescenza sarà visibile nei lisosomi, mentre vi è foto-attivazione nella TGN. Dopo l'arresto fotoattivazione, il βAPP-paGFP viene rapidamente eliminato dal lisosomi (confrontare Figura 1a a

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Discussione

Questa tecnica descrive l'esatto foto-attivazione delle proteine ​​di membrana taggati con paGFP nel TGN di visualizzare la successiva tratta e scissione. Mentre paGFP è stato creato oltre dieci anni fa 25, questo è il primo esempio di accurata foto-attivazione per seguire il traffico di proteine ​​nascenti ai compartimenti a valle. Studi precedenti utilizzando APP-paGFP costruisce foto-attivata una regione peri-nucleare della cellula, che è stato considerato il Golgi 11. Tuttavia, come evident...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari in competizione o conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione dell'Istituto Canadese per la Ricerca sulla Salute MOP 82890 a SHP. Gli autori desiderano ringraziare G.H. Patterson e J. Lippincott Schwartz per il costrutto paGFP. Le cellule SN56 sono state un dono della dottoressa Jane Rylett.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre di coltura con fondo in vetro da 35 mm MatekP-35G-1.5-20-C
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies14190-144
Hanks Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-092
Lipofectamine 2000Life Technologies11668019
Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11995-092
Penicilina/StreptomicinaLife Technologies15140-122
dibutirl ciclico AMPSigma D0627
Calore nel siero fetale bovino attivatoLife Technologies10082147
Inserto per microscopia riscaldata PPeCon GmbH
Tempcontrol 37– 2a scansione laser a 2 canali PeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META Carl Zeisscon diodo laser, laser ad argon e laser HeNe1
Lente ad immersione in olio ad apertura numerica Zeiss 63X 1.4Carl Zeiss
L685, 458 EMD Millipore565771disciolto in DMSO
cholorquine SigmaC6628 sciolto in acqua
NocodazoloSigmaM1404disciolto in DMSO
dimetil solfossidoSigma472301
ImarisBitplanecon pacchetto di colocalizzazione 
microscopio digitale

Riferimenti

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