二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）
Summary
Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.
Abstract
Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.
Introduction
タンパク質-タンパク質相互作用薬（PPI）は、生物学1の基本である、しっかりと多くの時間と長さスケール全体の時空間的機構を介して調節されています。細胞膜上の細胞シグナル伝達に対する研究は、例えば、特定のPPIおよび細胞プロセス2を容易に動的な、ナノスケール空間区画を明らかにしました。したがって、十分な空間的・時間的解像度、高い特異性、高感度で生物学的システムでのPPIを調査する能力は、生物学のメカニズムの理解を達成するための鍵です。
二分子蛍光相補（BIFC）は、細胞内の分解能でセル内のPPIを可視化するためのいくつかの既存のツールの一つであり、生細胞の互換性3から5 を 。技術は比較的簡単であり、2つの非蛍光フラグメントに蛍光タンパク質の分裂を伴います。遺伝的に2つの相互作用するタンパク質にタグ付けされたときに近接させ、フラグメントは、蛍光シグナルを生じる、完全な蛍光タンパク質を形成するように再構成することができます。適切に設計すると、BIFCプローブは自発的にのPPIの不存在下で再構成してはいけません。このように、BIFCアッセイにおける蛍光シグナルは、高い特異性でのPPIの直接可視化を可能にするのPPIの存在下で生じます。読み出しとして蛍光を使用することのさらなる利点は、とりわけ、高いスループットと高含有量スクリーニングアッセイ、と高感度、細胞内の解像度、および互換性があります。これらの利点のために、異なる親蛍光タンパク質に基づくBIFCプローブの数が開発されています。従来の光学顕微鏡法に基づいて、すべての他の検出手法のように、しかしながら、BIFCの空間分解能は、光の回折による〜250nmのに限定されています。これは、ナノスケールでのPPIの調節を研究するための挑戦になり、先に言及したと脂質ラフト6 aで例示されるようにします、NDラスナノクラスター7は 、そのようなシグナル伝達などの多くの細胞プロセスを理解するための重要な長さスケールです。
BIFCはPPIの10を撮像するための空間分解能でこの制限を克服するために、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）8,9と組み合わされています。 PALMは、確率論的活性化し、単一の蛍光分子のsubdiffractiveローカライズを通じて蛍光イメージングでの回折限界を回避する最近の超解像顕微鏡技術です。各作動サイクルでは、蛍光分子は、数千光子に数百を放射し、検出器上の単一分子の画像を生じます。画像は、回折限界（幅〜250 nm）であるが、その重心は、典型的には、検出された光子の数に応じて10〜50ナノメートルのオーダで、非常に高い精度で判定することができます。試料中の各蛍光分子を活性化し、局在化することにより、高解像度画像を再構成することができます。 Performe生細胞上のD、単一のセル11からのタンパク質の拡散軌跡の数千の単一分子追跡（smt-）PALMさらに許可取得。重要なのは、Palmは確率的な活性化を達成するために、このような光活性化蛍光タンパク質（PA-のFP）などの特殊な蛍光プローブを使用しています。 BIFCとPalm用の蛍光タンパク質の両方ので、それらは、アミノ酸159と160の間に2つの断片に、Palm用PAmCherry1、一般的に使用されるPA-FPを分割して組み合わせました。
分割PAmCherry1に基づいBIFCシステムは、2つの断片の自発的な再構成からの低バックグラウンドシグナルを示しています。遺伝的に相互作用するタンパク質のペアにタグ付けすると、2つの断片を（RN =は1から159残基; RC =メット+残基160から236）であっても37℃、より低い温度でインキュベートすることなく、完全なPAmCherry1タンパク質を形成するために、効率的に再構成し、これそのような親mCherryを13などの他のBIFCペア12には当てはまりません。 Furthermo再、再構成PAmCherry1タンパク質は、高コントラスト比、正確な単一分子の局在化と高解像度のPALM画像化のために重要である他、間中光子収量、高速光活性化、などの親PAmCherry1の光物理的特性を、保持していました。
このプロトコルでは、分割PAmCherry1（ 図1A）を用いて、U2OS細胞中のRas-Rafの相互作用を撮像するBIFC-PALMの使用が記載されています。最初のステップは、PAmCherry1フラグメント（ すなわち 、RN及びRC）と目的タンパク質との間の融合タンパク質を発現するための構築物を設計することです。理論的には、候補タンパク質（A及びB）の対ごとに、融合タンパク質の8組をテストするために存在する：RN-A / RC-B。 RN-A / B-RC。 RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; -RN / RC-B; -RN / B-RC。 -RC / RN-B;そしてA-RC / B-RN。このプロセスは、しばしば考慮候補タンパク質の構造的または生化学的特性を取ることによって簡略化することができます。 Rasの場合には、タンパク質であります翻訳後のC末端CAAXボックスで変更された（C =システイン、A =脂肪族; X =任意の）、その後、AAXモチーフが切断されます。したがって、RNまたはRCは、RasのN末端に融合することができます。これは、4つ（ 図1B）への融合タンパク質のペアの数を減少させます。 Rafは、Rasの結合ドメイン（RBD;残基51から131）が使用され、両端にタグを付けることができます。これら4融合構成が生成されました：RN-KRAS / RC-RafのRBD。 RN-KRAS / RafのRBD-RC。 RC-KRAS / RN-RafのRBD。 RC-KRAS / RafのRBD-RN。
さらに、フラグメントおよび目的のタンパク質との間のリンカーを考慮する必要があります。約10アミノ酸の柔軟なリンカーは、しばしば、それが相補性を生じるのに十分な自由度を提供するように使用されます。マルチクローニングサイト（MCS）14から生成されたランダムな配列を含む、正常に適用されてきた多くの人が、ありますが、そのようなリンカーは、（GGGGS）×2です。リンカーの長さはdependin最適化する必要があるかもしれません目的のタンパク質とその向きの相互作用の大きさにグラム。
PAmCherry1断片はのMCSに隣接すると、小さなクローニングバックボーンに含まれている（材料リストを参照してください）。目的の遺伝子は、制限部位を介して、またはライゲーション非依存の方法で挿入することができます。クローニングおよび配列確認の後、発現カセットは、リコンビナーゼ反応、高忠実度、高効率のクローニング法を使用して発現ベクターに移されます。
次に、得られた発現構築物は、標的細胞株を感染するためにレンチウイルスにパッケージング、安定な細胞株が所望される場合、標的細胞株にトランスフェクトまたはれています。一過性トランスフェクションは、BIFC構成の迅速な検証を可能にしますが、潜在的な問題に注意する必要があります。化学薬品を使用してトランスフェクションは、多くの場合、高い自己蛍光が得られ、細胞を強調。一方、全内部反射蛍光（TIRF）microscoの使用PPIは、細胞膜上で行われるときpyがTIRF理想、照明量を制限することにより、このバックグラウンド信号を軽減することができます。また、一過性トランスフェクションは、多くの場合、遠くのPPIの検出にアーチファクトを引き起こす可能性がある内因性タンパク質のものを超える、高レベルのタンパク質発現を導きます。したがって、それは、適切なBIFC設定が初期テストを通じて決定された後に安定な細胞株を確立することをお勧めします。安定な細胞株はまた、ドキシサイクリン誘導15を介して調節可能な発現の可能性を有します。
感染後、細胞を、抗生物質、典型的にはピューロマイシン、ネオマイシンで各構築物のための1つの選択されています。試料調製、画像収集、およびデータ分析のための後続のステップは、プロトコールに詳細に説明します。
このアプローチでは、ラス-RafのRBDのBIFC-PALM画像内のナノスケールのクラスターの形成が日常観察される（ 図2A </強いです>）。一貫して、ラス-RafのRBDのSMT-PALM軌道が拡散状態（ 図2B-D）での不均質な分布を示しています。これらの結果は、Ras-Rafの複合体は、潜在的な生物学的な意味で、おそらくモノマー及びクラスターとして、細胞膜上の複数の状態で存在することを示唆しています。この作業は、従来BIFC、蛍光の共局在化、または蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて得ることが困難となり、ナノメートルの空間分解能および単一分子感度を有する細胞でのPPIの選択的なイメージングにBIFC-PALMのパワーを示しています。
BIFC実験を設計し、その結果を解釈する際には、BIFCプロセスが分割PAmCherry1を含め、ほとんどの場合、中に不可逆的であることを心に留めておくことは重要です。二つの断片を組み合わせて、完全なPAmCherry1タンパク質、二つの断片間の結合を形成し、一旦このように、PPIは永続的になります。これはBIFCとBIFC-PALの使用を制限PPIのダイナミクス（ すなわち 、結合反応速度ではなく、それが形成されると、タンパク質複合体の拡散ダイナミクス）を監視すると、時間にMがあっても、PPI複合体の誤局在につながる可能性があります。
BIFC-PALM実験を設計する際に考慮すべき付加的な要因は、蛍光タンパク質に固有の発色団の成熟の遅れです。 2つのタンパク質が相互作用し、FPのフラグメントが一緒に来たら、彼らは一般的に数秒程度（EYFP 3 60秒のハーフタイム）にリフォールディング。しかし、その後の発色団の成熟と蛍光シグナルが分程度で開発しています。蛍光はスプリット金星、高速折りたたみYFP変異体の再構成後10分以内に検出することができるが、一般的には成熟のためのハーフタイムは、多くの場合、約60分で16です。分割PAmCherry1は、同様の速度を有することが観察されました。したがって、BIFCとBIFC-PALMは現在、リアルタイムのPPIの動態を監視するための悪い選択です。他の私このようなFRETと最近開発された二量体化に依存する蛍光タンパク質17としてthodsは、この目的のために、より適しているかもしれません。
Protocol
Representative Results
Discussion
PALMはそのまま生物学的試料のナノスケールイメージングを可能にし、最近の単一分子の超解像顕微鏡技術である間BIFCは、細胞内でのPPIを検出し、可視化するために一般的に使用される技術となっています。手のひらでBIFCの組み合わせは、ナノメートルの空間分解能と単一分子感度で、細胞内のPPIの選択的イメージングを達成しました。 BIFC-PALMは、両方の技術の有用性を拡張し、この作品?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Steven Chu and Joe W. Gray for helpful discussions, Henry Marr for his initial work on the BiFC-PALM project, and Alexis Shoemaker for her technical assistance. This work is supported by startup funds to X.N. from OHSU. Research in the Nan laboratory was also supported by NIH 5U54CA143836-05, the Damon Runyon Cancer Research Foundation, the M. J. Murdock Charitable Trust, and the FEI company.
Materials
| TIRF Microscope | Nikon | ||
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | ||
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Coherent | ||
| 405 nm laser | Coherent | ||
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25×36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | |||
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 mL tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
Riferimenti
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