Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation साथ Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (BiFC-पाम)
Summary
Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.
Abstract
Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.
Introduction
प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (पीपीआई) जीव विज्ञान 1 के लिए मौलिक हैं और कसकर कई समय और लंबाई पैमानों पर spatiotemporal तंत्र के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है। कोशिका झिल्ली पर संकेतन सेल पर अध्ययन, उदाहरण के लिए, विशिष्ट पीपीआई और सेलुलर प्रक्रियाओं 2 की सुविधा है कि गतिशील nanoscale, स्थानिक डिब्बों का पता चला है। इसलिए, पर्याप्त स्थानिक और लौकिक संकल्प, उच्च विशिष्टता है, और उच्च संवेदनशीलता के साथ जैविक प्रणालियों में पीपीआई की जांच करने की क्षमता जीव विज्ञान की एक यंत्रवत समझ प्राप्त करने की कुंजी है।
5 – Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरक (BiFC) subcellular संकल्प और लाइव सेल अनुकूलता 3 के साथ एक सेल में पीपीआई दृश्यमान करने के लिए कुछ मौजूदा उपकरणों में से एक है। तकनीक अपेक्षाकृत सरल है और दो गैर फ्लोरोसेंट टुकड़ों में एक प्रतिदीप्ति प्रोटीन के बंटवारे शामिल है; आनुवंशिक रूप से दो बातचीत प्रोटीन के लिए टैग और जबनिकटता में लाया, टुकड़े फ्लोरोसेंट संकेत उपज, एक पूरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए फार्म का पुनर्गठन कर सकते हैं। अच्छी तरह से डिजाइन करते समय, BiFC जांच अनायास पीपीआई के अभाव में पुनर्गठित नहीं किया जाना चाहिए। जैसे, एक BiFC परख में प्रतिदीप्ति संकेत केवल उच्च विशिष्टता के साथ पीपीआई के प्रत्यक्ष दृश्य सक्षम बनाता है जो पीपीआई की उपस्थिति में पैदा होगा। Readout के रूप में प्रतिदीप्ति का उपयोग कर का अतिरिक्त लाभ दूसरों के बीच उच्च throughput और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग assays के साथ उच्च संवेदनशीलता, subcellular संकल्प, और अनुकूलता हैं। इन लाभों के लिए, अलग माता पिता फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर आधारित BiFC जांच की एक संख्या विकसित किया गया है। पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी पर आधारित अन्य सभी पता लगाने की तकनीक के रूप में, हालांकि, BiFC के स्थानिक संकल्प प्रकाश के विवर्तन द्वारा ~ 250 एनएम तक सीमित है। इस लिपिड राफ्ट 6 एक से पहले alluded और उदाहरण के रूप में है, जो nanoscale है, पर पीपीआई के नियमन का अध्ययन करने के लिए यह एक चुनौती बना देता हैएन डी रास nanoclusters 7, इस तरह के संकेत दे के रूप में कई सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण लंबाई पैमाने पर है।
BiFC पीपीआई 10 इमेजिंग के लिए स्थानिक संकल्प में इस सीमा पर काबू पाने के लिए Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) 8,9 के साथ संयुक्त कर दिया गया है। पाम स्टोकेस्टिक सक्रियण और एक फ्लोरोसेंट अणु की subdiffractive स्थानीयकरण के माध्यम से प्रतिदीप्ति इमेजिंग में विवर्तन सीमा में गतिरोध उत्पन्न कि हाल ही में एक superresolution माइक्रोस्कोपी तकनीक है। प्रत्येक सक्रियण चक्र में, एक फ्लोरोसेंट अणु कुछ हजार फोटॉनों करने के लिए कुछ सौ उत्सर्जन करता है और डिटेक्टर पर एक अणु की छवि को जन्म देता है। छवि के विवर्तन सीमित है जबकि (~ चौड़ाई में 250 एनएम), उसके केन्द्रक आम तौर पर पता चला फोटॉनों की संख्या के आधार पर 10-50 एनएम के आदेश पर, बहुत उच्च परिशुद्धता के साथ निर्धारित किया जा सकता है। सक्रिय करने और नमूने में प्रत्येक फ्लोरोसेंट अणु स्थानीयकृत द्वारा, एक उच्च संकल्प छवि को खंगाला जा सकता है। Performeजीवित कोशिकाओं पर डी, एक एकल कोशिका 11 से प्रोटीन प्रसार प्रक्षेप पथ के हजारों के एक अणु ट्रैकिंग (smt-) पाम आगे परमिट अधिग्रहण। महत्वपूर्ण बात है, पाम स्टोकेस्टिक सक्रियण को प्राप्त करने के लिए इस तरह के photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन (पीए एफपीएस) के रूप में विशेष फ्लोरोसेंट जांच उपयोग करता है। BiFC और हाथ का प्रयोग फ्लोरोसेंट प्रोटीन दोनों के बाद से, वे अमीनो एसिड 159 और 160 के बीच दो टुकड़ों में, पाम के लिए PAmCherry1, आमतौर पर इस्तेमाल किया पीए एफपी बंटवारे से संयुक्त थे।
विभाजन PAmCherry1 पर आधारित BiFC प्रणाली के दो टुकड़े की सहज पुनर्गठन से कम पृष्ठभूमि संकेत से पता चलता है। आनुवंशिक रूप से बातचीत प्रोटीन की एक जोड़ी के लिए टैग, जब दो टुकड़े (आर एन = 1-159 अवशेषों, आर सी = मेट + अवशेषों 160-236) भी 37 डिग्री सेल्सियस पर और कम तापमान पर incubating के बिना पूरा PAmCherry1 प्रोटीन फार्म को कुशलता का पुनर्गठन, जो ऐसे माता-पिता mCherry के रूप में 13 अन्य BiFC जोड़े 12 के लिए मामला नहीं है। Furthermo, फिर से पुनर्गठित PAmCherry1 प्रोटीन ऐसी सटीक एक अणु स्थानीयकरण और उच्च संकल्प पाम इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं, जो दूसरों के बीच उच्च विपरीत अनुपात, मध्यम फोटोन उपज, और तेजी से photoactivation, के रूप में माता पिता PAmCherry1 की photophysical गुण, को बनाए रखा।
इस प्रोटोकॉल में, विभाजन PAmCherry1 (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके U2OS कोशिकाओं में रास-आरएएफ बातचीत इमेजिंग के लिए BiFC-ताड़ के उपयोग में वर्णित है। पहला कदम PAmCherry1 टुकड़े (यानी, आर.एन. और आर सी) और ब्याज की प्रोटीन के बीच संलयन प्रोटीन व्यक्त करने के लिए निर्माणों डिजाइन करने के लिए है। सिद्धांत रूप में, उम्मीदवार प्रोटीन (ए और बी) के प्रत्येक जोड़ी के लिए, संलयन प्रोटीन के आठ जोड़े का परीक्षण किया जा करने के लिए कर रहे हैं: आर.एन.-ए / आर सी बी; आर.एन.-ए / बी आर सी; आर सी ए / आर एन बी; आर सी ए / बी आर एन; ए आर एन / आर सी बी; ए आर एन / बी आर सी; ए आर सी / आर एन बी; और ए आर सी / बी आर एन। इस प्रक्रिया को अक्सर खाते में उम्मीदवार प्रोटीन के संरचनात्मक या जैव रासायनिक गुण लेने के द्वारा सरल बनाया जा सकता है। रास के मामले में प्रोटीन होता हैपोस्ट-translationally सी टर्मिनल CAAX बॉक्स में संशोधित (सी = Cys; एक = स्निग्ध, एक्स = कोई भी), जिसके बाद AAX मूल भाव बंद cleaved है। इसलिए, आर.एन. या आर सी ही रास के एन टर्मिनस से इनकार किया जा सकता है; इस चार (चित्रा 1 बी) के संलयन प्रोटीन जोड़े की संख्या कम कर देता है। आरएएफ के लिए, डोमेन रास बाध्यकारी (आरबीडी; अवशेषों 51-131) का इस्तेमाल किया जाता है और दोनों छोर पर टैग किया जा सकता। इन चार संलयन विन्यास उत्पन्न किया गया: आर.एन.-क्रास / आर सी-आरएएफ आरबीडी; आर.एन.-क्रास / आरएएफ आरबीडी-आर सी; आर सी-क्रास / आर एन-आरएएफ आरबीडी; और आर सी-क्रास / आरएएफ आरबीडी आर एन।
इसके अतिरिक्त, टुकड़े और ब्याज की प्रोटीन के बीच लिंकर विचार करने की आवश्यकता होगी। के बारे में दस अमीनो एसिड की एक लचीला लिंकर अक्सर यह पूरक होते हैं करने के लिए पर्याप्त स्वतंत्रता प्रदान करता है के रूप में प्रयोग किया जाता है। एक कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस) 14 से उत्पन्न यादृच्छिक दृश्यों सहित सफलतापूर्वक लागू किया गया है कि कई अन्य लोगों, वहाँ रहे हैं, हालांकि ऐसा ही एक लिंकर, (GGGGS) X2 है। linkers की लंबाई dependin अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती हैब्याज की प्रोटीन और उनके झुकाव जब बातचीत के आकार पर छ।
PAmCherry1 टुकड़े MCSS flanking के साथ एक छोटे से क्लोनिंग रीढ़ की हड्डी में समाहित कर रहे हैं (सामग्री सूची देखें)। ब्याज की जीन प्रतिबंध साइटों के माध्यम से या एक बंधाव स्वतंत्र विधि के साथ डाला जा सकता है। क्लोनिंग और अनुक्रम सत्यापन के बाद, अभिव्यक्ति कैसेट एक Recombinase प्रतिक्रिया, उच्च निष्ठा और उच्च दक्षता के साथ एक क्लोनिंग की प्रक्रिया का उपयोग कर एक अभिव्यक्ति वेक्टर को सौंप दिया है।
इसके बाद, जिसके परिणामस्वरूप अभिव्यक्ति निर्माणों लक्ष्य सेल लाइन को संक्रमित करने के लिए एक स्थिर सेल लाइन वांछित है, तो lentivirus में पैक, लक्ष्य सेल लाइन में ट्रांसफ़ेक्ट या कर रहे हैं। क्षणिक अभिकर्मक BiFC विन्यास के त्वरित सत्यापन के लिए अनुमति देता है, लेकिन संभावित समस्याओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए। अक्सर रसायनों का उपयोग अभिकर्मक उच्च autofluorescence, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं पर जोर दिया; जबकि कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) microsco का उपयोगPY पीपीआई कोशिका झिल्ली पर जगह ले जब रोशनी मात्रा TIRF आदर्श सीमित करके इस पृष्ठभूमि के संकेत को कम कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, क्षणिक transfections अक्सर दूर पीपीआई का पता लगाने में कलाकृतियों का कारण हो सकता है जो अंतर्जात प्रोटीन, उन लोगों से अधिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर तक ले। इसलिए, यह एक उचित BiFC विन्यास प्रारंभिक परीक्षण के माध्यम से निर्धारित किया गया है के बाद स्थिर सेल लाइनों की स्थापना की जा सिफारिश की है। स्थिर सेल लाइनों को भी डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण 15 के माध्यम से ट्यून करने योग्य अभिव्यक्ति के लिए क्षमता है।
संक्रमण के बाद, कोशिकाओं को आमतौर पर puromycin और प्रत्येक निर्माण के लिए neomycin, एक, एंटीबायोटिक दवाओं के साथ चुना जाता है। नमूना तैयार करने, छवि अधिग्रहण, और डेटा विश्लेषण के लिए बाद के चरणों प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित किया जाएगा।
इस दृष्टिकोण के साथ, रास-आरएएफ आरबीडी की BiFC-पाम छवियों में nanoscale समूहों के गठन नियमित तौर पर मनाया जाता है (2A चित्रा </ Strong>)। लगातार, रास-आरएएफ आरबीडी की श्रीमती पाम प्रक्षेप पथ प्रसार राज्यों (चित्रा 2 बी-डी) में एक विषम वितरण दिखा। इन परिणामों के रास-आरएएफ परिसरों संभावित जैविक प्रभाव के साथ, शायद monomers और समूहों के रूप में, कोशिका झिल्ली पर कई राज्यों में मौजूद है कि सुझाव देते हैं। इस काम के पारंपरिक BiFC, प्रतिदीप्ति सह स्थानीयकरण, या प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) के साथ प्राप्त करने के लिए मुश्किल होगा, जो नैनोमीटर स्थानिक संकल्प और एक अणु संवेदनशीलता के साथ कोशिकाओं में पीपीआई के चुनिंदा इमेजिंग में BiFC-हथेली की शक्ति को दर्शाता है।
BiFC प्रयोगों के डिजाइन और परिणामों की व्याख्या करते हैं, यह BiFC प्रक्रिया विभाजन PAmCherry1 सहित ज्यादातर मामलों में अपरिवर्तनीय है कि मन में रखने के लिए महत्वपूर्ण है। दो टुकड़े गठबंधन और एक पूरा PAmCherry1 प्रोटीन, दो टुकड़ों के बीच संबंध बनाने के लिए, और एक बार इस प्रकार पीपीआई स्थायी हो जाता है। इस BiFC और BiFC-पाल के उपयोग की सीमापीपीआई की गतिशीलता (यानी, बाध्यकारी कैनेटीक्स और न यह बनाई है एक बार प्रोटीन परिसर के प्रसार गतिशीलता) की निगरानी के लिए और समय पर एम भी पीपीआई परिसरों के mislocalization करने के लिए ले जा सकता है।
BiFC-पाम प्रयोगों को डिजाइन फ्लोरोसेंट प्रोटीन में निहित है कि क्रोमोफोर परिपक्वता में देरी है जब एक अतिरिक्त पहलू पर विचार करने के लिए। दो प्रोटीन बातचीत और एफपी के टुकड़े को एक साथ आने के बाद, वे आम तौर पर सेकंड (EYFP 3 के लिए 60 सेकंड के आधे समय) के आदेश पर refold। हालांकि, बाद में क्रोमोफोर परिपक्वता और फ्लोरोसेंट संकेत मिनट के आदेश पर विकसित करना। प्रतिदीप्ति विभाजन वीनस, एक तेजी से तह YFP संस्करण के पुनर्गठन के बाद 10 मिनट के भीतर पता लगाने योग्य हो सकता है, सामान्य रूप में परिपक्वता के लिए आधे समय अक्सर लगभग 60 मिनट 16 है। विभाजन PAmCherry1 समान दर है मनाया गया। इसलिए, BiFC और BiFC-पाम वास्तविक समय पीपीआई कैनेटीक्स की निगरानी के लिए वर्तमान में गरीब विकल्प हैं; अन्य मुझेऐसे झल्लाहट और एक हाल ही में विकसित dimerization निर्भर फ्लोरोसेंट प्रोटीन, 17 के रूप में thods, इस उद्देश्य के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पाम बरकरार जैविक नमूने के nanoscale इमेजिंग सक्षम बनाता है कि हाल ही में एक ही अणु superresolution माइक्रोस्कोपी तकनीक है, जबकि BiFC, का पता लगाने और कोशिकाओं में पीपीआई visualizing के लिए एक सामान्य तकनीक का इस्तेमाल किया गया है…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Drs. Steven Chu and Joe W. Gray for helpful discussions, Henry Marr for his initial work on the BiFC-PALM project, and Alexis Shoemaker for her technical assistance. This work is supported by startup funds to X.N. from OHSU. Research in the Nan laboratory was also supported by NIH 5U54CA143836-05, the Damon Runyon Cancer Research Foundation, the M. J. Murdock Charitable Trust, and the FEI company.
Materials
| TIRF Microscope | Nikon | ||
| 60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA | Nikon | ||
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm laser | Coherent | ||
| 405 nm laser | Coherent | ||
| 561 nm dichroic mirror | Semrock | Di01-R405/488/561/635-25×36 | |
| 561 nm filter | Semrock | FF01-525/45-25 | |
| 405/561 nm notch filter | Semrock | NF01-405/488/568-25 | |
| Temperature and CO2 controlled stage | |||
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Life Technologies | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Cloning | Clontech | 639649 | |
| LR Clonase | Life Technologies | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Packaging | Life Technologies | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfection Reagent | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155409 | #1.5 glass bottom dishes |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| 293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM with phenol red | Life Technologies | 11995 | |
| DMEM no phenol red | Life Technologies | 21063 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 | |
| Leibovit's L-15, no phenol red | Life Technologies | 21083-027 | |
| Reduced serum medium | Life Technologies | 31985 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14040 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe filter | Millipore | SLHV033RB | |
| Lentiviral concentrator | Clontech | 631231 | |
| Retroviral concentrator | Clontech | 631455 | |
| 10 cm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 6-well culture plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Life Technologies | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomycin |
| Doxycyline | Fisher | BP2653 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358 | |
| Magnesium chloride | Fisher | M33 | |
| 100 nm gold particles | BBI Solutions | EM.GC100 | |
| Molecular grade water | Life Technologies | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kit | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 mL tubes | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 mL polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 mL tube | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tube | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC medium | Life Technologies | 15544 | |
| LB broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | BP906 | |
| Competent cells | Life Technologies | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
Riferimenti
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