Kanaler til transport af vandmolekyler i enzymer indflydelse aktivt sted solvatisering og katalyse. Heri præsenterer vi en protokol for engineering af disse yderligere katalytiske motiver baseret på in silico computermodeller og eksperimenter. Dette vil øge vores forståelse af den indflydelse, opløsningsmidler dynamik på enzym katalyse.
Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.
Vand udgør en hjørnesten for kemien i livet 1. Vand mønstre og solvatisering af enzym aktive sites påvirker både enthalpi og entropi ligandbinding 1,2 og katalyse 3 i en meget kompleks måde strækker sig ud over den hydrofobe virkning 2,3. NMR 4, har kalorimetri 2 og molekylær modellering af opløste proteiner blevet brugt til at kaste lys over den rolle, som eksplicitte vandmolekyler i at yde en drivkraft for ligand forening 5-8, specificitet og aktivitet 2,9,10. Heri præsenterer vi en unik metode til eksperimentel vurdering af termodynamiske virkninger af opløsningsmiddel forskydning på enzym katalyse (figur 1). Vores kombinerede strategi er baseret på brug af computersimuleringer i koncert med enzym teknik og termodynamisk analyse (figur 1). Dette giver mulighed for at kaste yderligere lys over konsekvenserne af opløsningsmidler dynamik på catalysis, som i øjeblikket er dårligt forstået.
Stabiliserende enthalpic interaktioner, der leveres af vand-medieret hydrogenbindinger i solvateret enzym aktive steder, kan opvejes af entropiske sanktioner 1. Disse entropiske omkostninger er forbundet med faldet i antallet af frihedsgrader, der vises af vandmolekyler begrænset inden protein hulrum, sammenlignet med vand i bulk 5. Frigivelsen af bestilte vandmolekyler kan således give en entropisk drivkraft for ligand forening 1 og katalyse 3. Et centralt aspekt af opløsningsmidler dynamik er forskydningen af vandmolekyler mellem det indre af proteiner, og det ydre opløsningsmiddel 4. De ledsagende ændringer i aktiveringsenergien, enthalpi og entropi 11 ikke er fuldstændig forstået på det molekylære niveau. Ved at blokere enkelte tunneller er ansvarlige for transport af vand i enzymer, betydningen af opløsningsmidler dynamik og dets bidrag til aktiveringenergi kan evalueres (figur 1). Desuden ved at udføre ettrinssystemer kinetiske forsøg ved forskellige temperaturer, den relative termodynamiske aktiveringsparametre flere substrater kan ekstraheres fra et reduceret antal forsøg (figur 1, højre). Vores tværfaglige metode er valideret til komplekse membranbundne triterpen cyclase enzymer, der genererer polycykliske terpener af stor betydning for livet 12. Protokollen giver mulighed for inddrivelse af høje mængder af membranprotein (10-20 mg / l) ved hjælp af en standard centrifuge.
Selv om enzymer udviklet i vand, er den rolle af opløsningsmidlet i fremme katalyse normalt forsømt. Ud over protein dynamik 13,14 denne form pre-organiserede aktive sites med elektrostatisk komplementaritet til overgangen stand 15, kunne vand dynamik være af stor betydning for en effektiv enzym katalyse. Ved smedning flere tværfaglige teknikker, voresMålet er at lette den meget komplicerede undersøgelse af vanddynamik og termodynamik. At gøre disse redskaber mere tilgængelige for det videnskabelige samfund vil føre til udvikling af nye strategier i enzym-ingeniør og protein design til ændrede aktiviteter og særlige.
De mest kritiske trin i at opnå en høj kvalitet eksperimentelle termodynamiske data for vildtype-enzym og tunnel membran varianter er: 1) generering af computermodellen; 2) homogent oprensede proteiner; 3) emulgerede substrat lagre; 4) styring af temperatur under kinetik; 5) udvinding af reaktionsblandinger hjælp intern standard.
Den generation af computermodellen er stærkt lettes ved anvendelse af en software med en brugervenlig grænseflade, der understøtter en række forskellige platforme. Derfor er denne protokol bygger på den YASARA modellering pakken 16 at gøre vores strategi tilgængelig, selv at modellere ikke-eksperter. En computermodel til identifikation vandtunnel bør ideelt være baseret på en krystalstruktur af enzymet af interesse 24. Til dette formål, det væld af krystalstrukturer rådighed i Protein Data Bank er meget gavnligt. Det er vores erfaring, et centralt aspekt i vellykket forberedelse af templader til identifikation tunnel er at holde krystallografiske farvande. Det er lige så vigtigt at bruge en solvateret enzym kasse, når du udfører molekylære simuleringer, som kan køre på en normal computer. Triterpenen cyclase fra Alicyclobacillus acidocaldarius er stabilt i vand under MD simuleringer 3. Men holde krystallografiske detergenter og / eller ved hjælp af cellemembran efterligner måske ville være behov for potentielt ustabile enzymer for at muliggøre udvidede MD simuleringer. Det forudses, at den minimerede krystalstrukturen af meget vanskelige mål kunne give vigtig mekanistisk indsigt under anvendelse af protokollen, skønt dette ikke ville fange dynamiske aspekter af tunnelen organisation.
Caver 19 i den grundlæggende tilstand, med en enkelt eller et begrænset antal snapshots som input, kan bruges af ikke-eksperter på en standard bærbar computer. Baseret på vores erfaring 3, tunneler med en flaskehals radius (dvs. radiuspå det mest snævre punkt) er mindre end 1 Å kan være yderst relevante for vand, især hvis krystallografiske vandmolekyler opholde sig forudsagte tunnel (figur 1, midterste venstre). På den anden side kunne en større flaskehals radius medfører en tunnel til transport af substratet i og ud af det aktive sted 10. Scriptet i supplerende kodeks File 2 kan anvendes af ikke-eksperter til visualisering af forudsagte tunneler. Fremtidige eksperimenter vil afsløre, om homologi modeller vil være tilstrækkeligt høj opløsning for at tillade atomistiske undersøgelse af vandnet og dynamik. Kaste lys over, hvordan du udfører molekylære simuleringer, med og uden en ligand til stede i det aktive site, påvirker processen med identifikation tunnel vil også være af betydning.
Kinetik af membranproteiner kan udgøre en formidabel udfordring 25. Protokollen heri er baseret på en simpel membranekstraktion protokolat opnå enzym membranen uden brug af dyrt udstyr, såsom en ultracentrifuge. Anvendelsen af gelfiltrering som en endelig polering trin fjerner potentielle tilbageværende membran partikler og giver mulighed for at definere et passende detergent miljø 25.
Et centralt aspekt i at opnå reproducerbare kinetiske følge af protokollen er at emulgere underlaget stamopløsningen ved ultralydsbehandling. Enkel vortexing af hydrofobe substrater fortyndet i reaktionspuffer giver inhomogene substrat-detergent-blandinger. Den pipettering af ikke-emulgerede substratopløsninger fører til reproducerbare koncentrationer (bekræftet ved kvantitativ GC), hvilket forhindrer nøjagtig bestemmelse af de oprindelige satser. Derimod bør den afpipettering af korrekt emulgerede stamopløsninger resultere i lineær regressionsanalyse af de oprindelige satser med R2 i intervallet 0,98-0,99. Et andet vigtigt aspekt af hydrofobe substrater er den tilsyneladende substrat opløselighedog tilgængelighed i substrat-vaskemiddel blandinger. Faktisk var det ikke muligt at mætte triterpene cyclase med henvisning substrat squalen. Af denne grund tilsyneladende kcat / er K M værdier præsenteret heri, som kan indeholde bidrag fra både bindende og kemi. Det har imidlertid vist sig, at kemien er hastighedsbegrænsende for kcat / KM for polycyclization kaskade udført af triterpene cyclaser 3.
Det er af stor betydning for at kontrollere den aktuelle temperatur inde i en hætteglas reaktion glas med en ekstern termometer. Alligevel kan lineære passer være dårligere for varianter med essentiel konstante tilsyneladende k cat / K M værdier ved forskellige temperaturer. Dette understreges for S168F variant heri (figur 2A) med en aktivering entalpi tæt på nul (figur 2B og 2C). Meget small temperaturafhængige ændringer i tilsyneladende kcat / KM, kunne inducere usikkerhed i den observerede aktivering entropi Δ S ‡ (dvs. skæringspunktet i den lineære plots i figur 2B). I princippet kunne den observerede aktivering entropi også blive påvirket af en anden overflod af aktive enzymer for forskellige varianter, som ikke ville blive detekteret ved at måle proteinkoncentrationen. Det forventes, at eksperimentelle fejl er reduceret ved blanding flere substrater i en gryde. Dette skyldes, at alle de forskellige substrater interagere med den samme mængde enzym under disse omstændigheder (ligning 4). Anvendelsen af et ekstraktionsmiddel tilsat en intern standard er vigtigt at tage højde for forskelle i udtræk og / eller GC-injektion.
Transition state teori er blevet anvendt med succes i Enzymology 26. Denne vigtige teoretiske ramme blev oprindeligt deudviklet til unimolekylær reaktioner i gasfase. Det har imidlertid vist sig, at enzymer virker primært ved at sænke den klassiske aktiveringsenergi barriere 26. Transmissionskoefficienten antages at være en heri kan påvirke den målte aktivering enthalpi og / eller entropi. Bidraget fra tunnelering, og andre ikke-klassiske effekter såsom recrossing af overgangen tilstand, kan groft bidrager 1000-fold til katalyse 26 svarende til ca. 4 kcal / mol med energi. Det kan ses, at aktiveringen entropi vises af vildtype-enzymet (16 kcal / mol ved 328 K, figur 2C) er meget større end sådanne ikke-klassiske virkninger forårsaget af en uensartet transmissionskoefficient. Virkningen af transmissionen koefficient bør falde, når man sammenligner termodynamiske parametre for aktivering for vildtype og tunnel varianter ved hjælp af protokollen.
Den Gibbs fri energi for aktivering (Δ G ‡) er komposed af både en enthalpic (Δ H ‡) og en entropisk (- T * Δ S ‡) sigt. Opløsningsmiddel reorganisering i enzymer under katalyse kan påvirke begge parametre. Forventes den nuværende protokol for at lette studiet af disse fænomener ved at samle en værktøjskasse med relevante og brugervenlige i silico beregningsværktøjer med den nødvendige biofysiske eksperimentelle rammer. Fremgangsmåden forudses at være nyttig til at undersøge et væld af enzymatiske processer, herunder katalyse af membranbundne enzymer.
The authors have nothing to disclose.
The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.
YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |