Kanaler för transport av vattenmolekyler i enzymer påverkar aktivt ställe solvatisering och katalys. Häri presenterar vi ett protokoll för konstruktion av dessa ytterligare katalytiska motiv baserade på in silico datormodellering och experiment. Detta kommer att öka vår förståelse av påverkan av lösningsmedel dynamik på enzymkatalys.
Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.
Vatten utgör en hörnsten för livets kemi 1. Vattenmönster och solvatisering av enzym aktiva ställen påverkar både entalpin och entropi av ligandbindning 1,2 och katalys 3 på ett mycket komplext sätt som sträcker sig bortom den hydrofoba effekten 2,3. NMR 4, kalorimetri 2 och molekylär modellering av lösta proteiner har använts för att belysa betydelsen av explicita vattenmolekyler för att ge en drivkraft för ligand förening 5-8, specificitet och aktivitet 2,9,10. Häri presenterar vi en unik metod för experimentell bedömning av termodynamiska effekter förskjutning lösningsmedel på enzymkatalys (Figur 1). Vår samlade strategin bygger på att använda datorsimuleringar i samförstånd med enzymteknik och termodynamisk analys (Figur 1). Detta gör det möjligt att kasta ytterligare ljus över effekterna av lösningsmedels dynamik på catalys, som för närvarande är dåligt förstådd.
Stabiliserande enthalpic interaktioner, som tillhandahålls av vatten medierad vätebindningar i solvatiserad enzym aktiva ställen, kan kompenseras genom entropiska straff 1. Dessa entropiska kostnader i samband med minskning av frihetsgrader visas av vattenmolekyler begränsade inom protein håligheter, jämfört med vatten i bulk 5. Frisläppandet av beställda vattenmolekyler kan därmed ge en entropisk drivkraft för ligand förening 1 och katalys 3. En viktig aspekt av lösningsmedels dynamik är förskjutningen av vattenmolekyler mellan det inre av proteiner och det yttre lösningsmedlet 4. De medföljande förändringar i aktiveringsenergi, entalpi och entropi 11 är inte klarlagd på molekylär nivå. Genom att hindra enskilda tunnlar som är ansvariga för transport av vatten i enzymer, vikten av lösningsmedels dynamik och dess bidrag till aktiveringsenergi kan utvärderas (Figur 1). Dessutom, genom att utföra en pott kinetiska experiment vid olika temperaturer, de relativa termodynamiska aktiveringsparametrarna för flera substrat kan utvinnas ur ett minskat antal experiment (figur 1, höger). Vår tvärvetenskapliga metod är validerad för komplexa membranbundna triterpen cyklas enzymer som genererar polycykliska terpener av stor betydelse för livet 12. Protokollet möjliggör återvinning av höga mängder av membranprotein (10-20 mg / L) med användning av en standardcentrifug.
Även enzymer utvecklades i vatten, är den roll av lösningsmedlet för att främja katalys vanligtvis försummas. Förutom proteindynamik 13,14 som formar förväg organiserade aktiva platser med elektro komplement till övergångstillståndet 15, kan vattendynamik vara av stor betydelse för effektiv enzymkatalys. Genom smidning flera tvärvetenskapliga metoder, vårSyftet är att underlätta den mycket komplexa studie av vattendynamik och termodynamik. Att göra dessa verktyg mer tillgängliga för forskarvärlden kommer att leda till utveckling av nya strategier i enzymteknik och proteindesign för förändrade aktiviteter och särdrag.
De mest kritiska stegen i att uppnå hög kvalitet experimentella termodynamiska data för vildtyp membranenzym och tunnel varianter är: 1) generation av datormodell; 2) homogent renade proteiner; 3) emulgerade substratlager; 4) kontroll av temperaturen under kinetik; 5) utvinning av reaktionsblandningar med hjälp av intern standard.
Genereringen av datormodellen i hög grad underlättas genom användningen av en programvara med ett användarvänligt gränssnitt som stöder en mängd olika plattformar. Därför är detta protokoll nämnas först på YASARA modellering suite 16 för att göra vår strategi tillgänglig även för modellering icke-experter. En datormodell för vattentunnel identifiering bör helst baseras på en kristallstruktur av enzymet av intresse 24. För detta ändamål, är mycket fördelaktigt den rikedom av kristallstrukturer som finns i proteindatabank. I vår erfarenhet, en viktig aspekt i den framgångsrika framställningen av templattor för tunnelidentifiering är att hålla kristallo vatten. Det är lika viktigt att använda en solvatiserad enzym ruta när du utför molekyldynamiksimuleringar, som kan köras på en vanlig dator. Triterpene cyklas från Alicyclobacillus acidocaldarius är stabilt i vatten under MD simuleringar 3. Men att hålla kristallo detergenter och / eller genom att använda cellmembran härmar kanske skulle krävas för potentiellt instabila enzymer för att medge under utsträckta MD simuleringar. Det är tänkt att den minimerade kristallstrukturen av mycket utmanande mål kan ge viktiga mekanistiska insikter med hjälp av protokollet, även om detta inte skulle fånga dynamiska aspekterna av tunnel organisation.
Caver 19 i grundläget, med en enda eller ett begränsat antal bilder som indata, kan användas av icke-experter på en vanlig bärbar dator. Baserat på vår erfarenhet 3, tunnlar med en flaskhals radie (dvs. radienvid den smalaste punkten) mindre än 1 Å kan vara mycket relevant för vatten, särskilt om kristallovattenmolekyler uppehålla sig inom den förutsagda tunneln (Figur 1, mitten till vänster). Å andra sidan kan en större flaskhals radie medför en tunnel för transport av substratet i och ut ur det aktiva stället 10. Skriptet i Tilläggskodex File 2 kan användas av icke-experter för visualisering av förväntade tunnlar. Framtida experiment kommer att avslöja om homologi modeller kommer att vara tillräckligt hög upplösning för att möjliggöra atomistisk studie av vattennätverk och dynamik. Belysa hur utför molekyldynamiksimuleringar, med och utan en ligand närvarande i det aktiva stället, påverkar processen för tunneln identifiering skulle också vara av betydelse.
Kinetics av membranproteiner kan utgöra en väldig utmaning 25. Protokollet är baserad på en enkel membran extraktion protokollatt erhålla membranenzym utan användning av dyrbar utrustning, såsom en ultracentrifug. Användningen av gelfiltrering såsom en slutlig polering avlägsnar potentiella resterande membranpartiklar och möjliggör för att definiera en lämplig tvättmedel miljö 25.
En viktig aspekt för att uppnå reproducerbara kinetiska resultat från protokollet är att emulgera substratstamlösning genom ultraljuds. Enkel virvling av hydrofoba substrat utspädda i reaktionsbufferten ger inhomogena blandningar substrattvättmedels. Den pipettering av icke-emulgerade substratlösningar leder till reproducerbara koncentrationer (bekräftas av kvantitativ GC), vilket förhindrar noggrann bestämning av initiala priser. Däremot bör pipettering av korrekt emulgerade stamlösningar resultera i linjär regressionsanalys av initiala priser med R 2 i området av 0,98 till 0,99. En annan viktig aspekt av hydrofoba substrat är den skenbara substratet löslighetenoch tillgänglighet i blandningarna substrattvättmedels. I själva verket var det inte möjligt att mätta triterpenen cyklas med referenssubstrat skvalen. Av detta skäl framgår kcat / M-värden presenteras häri, vilka kan innehålla bidrag från både bindning och kemi. Det har emellertid visats att kemin är hastighetsbegränsande för kcat / Km för polycyclization kaskaden som utförs av triterpene cyclases 3.
Det är mycket viktigt att kontrollera den faktiska temperaturen inuti en reaktionsglasflaska med en extern termometer. Ändå kan linjära passar vara sämre för varianter med essentiell konstant uppenbara k cat / K M-värden vid olika temperaturer. Detta betonas för S168F varianten häri (Figur 2A) med en aktiverings entalpi nära noll (figur 2B och 2C). Mycket small temperaturberoende förändringar i uppenbar k cat / K M, kan ge upphov till osäkerhet i observerade aktiverings entropi Δ S ‡ (dvs skärningen i de linjära tomter i figur 2B). I princip skulle den observerade aktiverings entropi också påverkas av en annan förekomst av aktiva enzymer för olika varianter, som inte skulle upptäckas genom att mäta proteinkoncentrationen. Det förväntas att experimentella fel reduceras vid blandning flera substrat i en kruka. Detta beror på att alla de olika substraten växelverkar med samma mängd enzym under dessa förhållanden (ekvation 4). Användningen av ett extraktionslösningsmedel spetsat med en intern standard är viktigt att ta hänsyn till skillnader under extraktion och / eller GC-injektion.
Övergångstillstånds teori har med framgång använts i enzymologi 26. Denna viktiga teoretiska ramverk ursprungligen frånutvecklats för unimolekylära reaktioner i gasfasen. Det har emellertid visats att enzymerna fungerar huvudsakligen genom att sänka den klassiska aktiveringsenergibarriären 26. Transmissionskoefficienten antas vara ett dokument kan påverka den uppmätta aktiverings entalpi och / eller entropi. Bidraget från tunneldrivning, och andra icke-klassiska effekter såsom återkorsning av övergångstillståndet, kan grovt bidra 1000-faldigt till katalys 26 motsvarande ca 4 kcal / mol i energi. Det kan ses att aktiverings entropin visas av vildtypsenzymet (16 kcal / mol vid 328 K, figur 2C) är mycket större än sådana icke-klassiska effekter som orsakas av en ojämn transmissionsfaktorn. Effekterna av transmissionskoefficienten ska minska när man jämför termodynamiska parametrar för aktivering för vildtyp och tunnel varianter som använder protokollet.
Gibbs fria energi för aktivering (Δ G ‡) är kompoSED både en enthalpic (Δ H ‡) och en entropisk (- T * Δ S ‡) sikt. Lösningsmedel omorganisation enzymer under katalys kan påverka båda parametrarna. Den nuvarande protokollet väntas underlätta studier av dessa fenomen genom att samla en verktygslåda av relevanta och användarvänliga in silico beräkningsverktyg med nödvändig biofysiska experimentell ram. Metoden är tänkt att vara användbara för att studera en mängd enzymatiska processer, inklusive katalys av membranbundna enzymer.
The authors have nothing to disclose.
The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.
YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |