تسليم والبروتينات، والببتيدات أو خلية بردة الجزيئات الصغيرة إلى الخلايا الحية التي الحضانة مع Endosomolytic الكاشف dfTAT
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
استراتيجيات تسليم الجزيئات عادة الاستفادة من مسار التقامي كطريق من دخول الخلوية. ومع ذلك، endosomal انحباس يحد بشدة من الكفاءة التي الجزيئات تخترق الفضاء عصاري خلوي من الخلايا. مؤخرا، قمنا التحايل على هذه المشكلة عن طريق تحديد كاشف dfTAT، وديمر السندات ثاني كبريتيد من TAT الببتيد المسمى مع tetramethylrhodamine fluorophore. لقد ولدت ديمر fluorescently المسمى من تنميط الببتيد اختراق الخلية (CPP) TAT، dfTAT، التي تخترق الخلايا الحية وتصل مساحة عصاري خلوي من الخلايا مع كفاءة عالية للغاية. ويتحقق تسليم عصاري خلوي من dfTAT في خطوط الخلايا متعددة، بما في ذلك الخلايا الأولية. وعلاوة على ذلك، والتسليم لا يؤثر بشكل ملحوظ بقاء الخلية، وانتشار أو التعبير الجيني. dfTAT يمكن أن يحقق الجزيئات، والببتيدات، والأجسام المضادة، والانزيمات النشطة بيولوجيا صغيرة وعامل النسخ. في هذا التقرير، وصفنا البروتوكولات تشارك في dfTAالتوليف T والتسليم الخلوية. يصف المخطوطة كيفية السيطرة على كمية من البروتين تسليمها إلى الفضاء عصاري خلوي الخلايا من خلال تغيير كمية البروتين تدار خارج الخلية. وأخيرا، تناقش القيود الحالية من هذه التكنولوجيا الجديدة والخطوات المتبعة في التحقق من صحة التسليم. يجب أن تكون البروتوكولات المذكورة مفيدة للغاية لفحوصات خلية القاعدة فضلا عن التلاعب فيفو السابقين وإعادة برمجة الخلايا.
Introduction
تسليم البروتينات والببتيدات أو خلايا غير منفذة جزيئات صغيرة في الخلايا الحية أمر مرغوب فيه في العديد من التطبيقات البيولوجية أو التكنولوجيا الحيوية (التصوير الخلوي، المقايسات الفنية، إعادة برمجة الخلايا، الخ.) 1-4. وقد سبق أن ذكرت العديد من المناهج التسليم، بما في ذلك microinjection، Electroporation لل، أو استخدام وكلاء الناقل (على سبيل المثال، الببتيدات اختراق الخلية مثل TAT، والدهون) 5-7. كل تقنية وعادة إيجابيات وسلبيات المحددة التي قد تجعل هذه النهج كافية لبعض التطبيقات ولكن ليس للآخرين. وتشمل القضايا المشتركة الكفاءة تسليم الفقيرة و / أو عدم وجود رقابة من كمية المواد يتم تسليم 8،9، سمية أو ضار تأثير الفسيولوجية 10،11، عدم وجود رقابة الزمنية، والتسليم في خلايا قليلة ولكن ليس في السكان (على سبيل المثال، microinjection) 12، ومعقدة الاقتران الكيميائية أو صياغة خطط 11.
<p clas الصورة = "jove_content"> في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير استراتيجية تسليم الرواية التي تلتف حول هذه القيود. وتعتمد هذه الاستراتيجية على الببتيد اسمه dfTAT (ديمر TAT الفلورسنت) 13. مشتق dfTAT من الببتيد نعرف جيدا اختراق خلايا (CPP) TAT. dfTAT يحتوي على اثنين من كبريتيد العبودي نسخ من TAT المسمى مع tetramethylrhodamine fluorophore. وعلى الرغم من أوجه الشبه بينهما، TAT وdfTAT تختلف اختلافا كبيرا في النشاط. وعادة ما المنضوية TAT في الخلايا عن طريق الإلتقام. ولكن هذا CPP لا يزال محتجزا في الغالب داخل الإندوسومات (هذا يؤدي عادة إلى توزيع منقط من الببتيد داخل الخلايا عندما فحصت بواسطة المجهر مضان). مثل TAT، وendocytosed dfTAT بكفاءة عن طريق الخلايا. ومع ذلك، dfTAT لا البقاء محاصرين داخل الإندوسومات. بدلا من ذلك، انها تتوسط تسرب endosomal بطريقة غير فعالة للغاية. النشاط endosomolytic من dfTAT ثم يمكن استغلاله لتقديم الجزيئات عن طريق فحص بسيط الحضانة. ntent "> والفهم الحالي لعملية التسليم على النحو التالي. dfTAT يدفع macropinocytosis. ونتيجة لذلك، والخلايا المحتضنة مع dfTAT يستغرق بروتينات قابلة للذوبان، والببتيدات، أو جزيئات صغيرة (جزيئات من الفائدة، وزارة الداخلية) موجودة في وسائل الإعلام من قبل المائع- الإلتقام (انظر الشكل 1). التفاعلات بين dfTAT وزارة الداخلية ليست ضرورية ما دام كل حركة المرور الكيانات معا ضمن مسار التقامي. وتصل dfTAT عتبة معينة داخل تجويف العضيات التقامي، فإنها تعرب عن النشاط تسرب endosomal لها (التفاصيل الجزيئية يبقى أن يميز تماما). مضمون لمعة من العضيات تتسرب منها المياه، وبالتالي فإن وزارة الداخلية، ثم يتم إطلاقها في الخلايا، وبالتالي هذا النهج غير مريحة للغاية كما ليس هناك حاجة لتصريف الافعال أو صياغة خطط مع وزارة الداخلية. وعلاوة على ذلك، لأن dfTAT هو لا تعديل وزارة الداخلية مباشرة، فإنه ينبغي أيضا أن لا تتداخل مع وظيفة موييس مرة واحدة ويتحقق تسليم داخل الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تركيزتستخدم dfTAT التسليم مستقل من أن من وزارة الداخلية في وسائل الإعلام. على سبيل المثال، تركيز dfTAT يمكن أن تظل ثابتة بين التجارب المختلفة لضمان الكفاءة استنساخه في تسرب endosomal. في المقابل، وتركيز وزارة الداخلية في وسائل الإعلام يمكن أن تتغير تدريجيا لتحقيق المستويات المنشودة من وزارة الداخلية تسليمها في العصارة الخلوية.ارتفاع endosomal كفاءة تسرب تحقق مع dfTAT هي غير ضارة بشكل ملحوظ إلى العديد من الخلايا اختبار حتى الآن. هذا هو مفاجأة لأن العضيات التقامي هي عنصر هام من عناصر الخلايا ويتوقع المرء أن تسرب مثيرة بوساطة dfTAT سيرافق الاستجابات الخلوية الضارة. ومع ذلك، وتتكاثر الخلايا المعالجة في نفس معدل الخلايا غير المعالجة وعدم عرض أي تغييرات كبيرة في Transcriptome على الخاصة بهم. وعلاوة على ذلك، يمكن تكرار التسليم في غضون دقائق مع كفاءات تسليم استنساخه، مشيرا إلى أن الخلايا إما أن يتسامح أو التعافي من عملية التسليم دون أن تفقدقدرتها على الإلتقام أو تسرب endosomal. الاستجابات الخلوية خفية قد يتحقق أثناء الولادة dfTAT والتفاصيل الجزيئية ما يمكن أن تبقى هذه الردود من يكتشفها. بعد، من خلال الجمع بين الكفاءة العالية، والراحة من البروتوكولات، وعدم وجود سمية، يجب أن هذا النهج تسليم يكون مفيدا على الفور في العديد من التطبيقات المستندة إلى الخلية. وتهدف البروتوكولات الواردة في هذه الوثيقة إلى جعل هذه التكنولوجيا في متناول المجتمع البحثي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخلايا المستخدمة للتسليم dfTAT لا ينبغي أن تكون متموجة بشكل مفرط (> 90٪ confluency) لأن هذا قد يؤثر على كفاءة التسليم. وينبغي أيضا أن تكون الخلايا السليمة: الخلايا الميتة في الثقافة يمكن أن يطلق شظايا أفكارك التي dfTAT يمكن أن تتفاعل (على سبيل المثال، الحمض النووي من ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
Riferimenti
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
- Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
- Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
- Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
- Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
- Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
- Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
- Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
- Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
- Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
- Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).
