Levering af proteiner, peptider eller celleimpermeable små molekyler i levende celler ved inkubering med Endosomolytic Reagent dfTAT
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
Makromolekylære strategier levering typisk udnytter endocytiske vej som en rute for cellulær indrejse. Men endosomale indfangning alvorligt begrænser den effektivitet, hvormed makromolekyler trænger cytosol plads af celler. Vi har for nylig omgået dette problem ved at identificere reagenset dfTAT, en disulfidbinding dimer af peptidet TAT mærket med fluorophoren tetramethylrhodamin. Vi har genereret en fluorescens-mærket dimer af prototypiske cellepenetrerende peptid (CPP) TAT, dfTAT, som trænger levende celler og når det cytosoliske rum af celler med en særlig høj effektivitet. Cytosolisk levering af dfTAT opnås på flere cellelinier, herunder primære celler. Desuden indeholder levering ikke mærkbart påvirker celle levedygtighed, proliferation eller genekspression. dfTAT kan levere små molekyler, peptider, antistoffer, biologisk aktive enzymer og en transkriptionsfaktor. I denne rapport beskriver vi er involveret i frihandelsaftale protokollerT-syntese og cellulær levering. Manuskriptet beskriver, hvordan man styrer mængden af protein leveret til cytosoliske rum af celler ved at variere mængden af indgivet protein ekstracellulært. Endelig er de nuværende begrænsninger i denne nye teknologi og trin i validering levering diskuteret. De beskrevne protokoller bør være særdeles nyttige til cellebaserede assays samt til ex vivo manipulation og omprogrammering af celler.
Introduction
Levering af proteiner, peptider eller celleimpermeable små molekyler i levende celler er ofte ønskeligt i mange biologiske eller bioteknologiske anvendelser (cellulær billeddannelse, funktionelle assays, cellulære omprogrammering osv.) 1-4. Mange leveringsmetoder er allerede blevet rapporteret, herunder mikroinjektion, elektroporation, eller brug af carrier stoffer (f.eks., Celle-gennemtrængende peptider såsom TAT, lipider) 5-7. Hver teknik typisk har specifikke fordele og ulemper, der kan gøre disse tilgange tilstrækkelig til visse anvendelser, men ikke for andre. Almindelige problemer omfatter dårlige levering effektivitet og / eller manglende kontrol med, hvor meget materiale leveres 8,9, toksicitet eller skadelig fysiologisk virkning 10,11, manglende tidsmæssig kontrol, levering i få celler, men ikke i en hel befolkning (f.eks., mikroinjektion) 12 og komplekse kemiske konjugationsfremgangsmåder eller formulering ordninger 11.
<p clas s = "jove_content"> For nylig har vi udviklet en ny leverance strategi, der omgår disse begrænsninger. Denne strategi er baseret på en peptid med navnet dfTAT (dimer fluorescerende TAT) 13. dfTAT er afledt af det velkendte cellepenetrerende peptid (CPP) TAT. dfTAT indeholder to disulfidbundne kopier af TAT mærket med fluorophoren tetramethylrhodamin. På trods af deres ligheder, TAT og dfTAT afviger betydeligt i aktivitet. TAT typisk internaliseres i cellerne ved endocytose. Dette CPP forbliver dog det meste fanget inde endosomer (dette normalt føre til en punktformet fordeling af peptidet inde celler, når undersøgt ved fluorescens mikroskopi). Ligesom TAT, er dfTAT effektivt endocytose af celler. Men dfTAT ikke holde fanget inde endosomer. I stedet er det medierer endosomale lækage på en måde, der er yderst effektiv. Den endosomolytic aktivitet dfTAT kan derpå udnyttes til at opnå makromolekyler ved simpel inkubering assay. ntent "> Den nuværende forståelse af leveringen proces er som følger. dfTAT inducerer macropinocytosis. Som et resultat, celler inkuberet med dfTAT tage op opløselige proteiner, peptider eller små molekyler (molekyler af interesse, MOI) er til stede i medier ved fluid-fase endocytose (se figur 1). Interaktioner mellem dfTAT og MOI er ikke nødvendige, så længe begge enheder trafik sammen inden for endocytiske pathway. Som dfTAT når en vis tærskel i lumen endocytiske organeller, det udtrykker sin endosomal lækage aktivitet (de molekylære detaljer fortsat at være fuldstændigt karakteriseret). Indholdet af lumen utætte organeller, og derfor MOI, frigives derpå i cellerne. Denne fremgangsmåde er derfor meget praktisk som ingen konjugationsprocedurer eller formulering ordninger med MOI er påkrævet. Desuden, på grund dfTAT er ikke direkte at modificere en MOI, bør det heller ikke forstyrre MOI fungere, når intracellulær administration opnås. Hertil kommer, at koncentrationen afdfTAT brugte levering er uafhængig af MOI i medierne. For eksempel kan dfTAT koncentration holdes konstant mellem forskellige forsøg på at sikre reproducerbare effektivitet i endosomale lækage. I modsætning hertil kan koncentrationen af MOI i medier gradvis ændres for at medføre ønskede niveauer af MOI leveres i cytosol.Den høje endosomale lækage effektivitet opnås med dfTAT er bemærkelsesværdigt uskadeligt for mange af de hidtil testede celler. Dette er en overraskelse, fordi endocytiske organeller er vigtig del af cellerne, og man ville forvente, at den dramatiske lækage medieret af dfTAT ville blive ledsaget af ødelæggende cellulære responser. Alligevel behandlede celler formere i samme tempo som ubehandlede celler, og viser ikke nogen væsentlige ændringer i deres transkriptom. Desuden kan leveringen blive gentaget inden for få minutter med reproducerbare levering effektivitet, hvilket indikerer, at cellerne enten kan tåle eller inddrive fra leveringen processen uden at mistederes evne til endocytose eller endosomale lækage. Subtile cellulære reaktioner kan finde sted i løbet dfTAT levering og de molekylære detaljer om, hvad disse reaktioner kan være mangler at blive udforsket. Men ved at kombinere høj effektivitet, bekvemmelighed protokoller, og mangel på toksicitet, bør denne levering tilgang vise sig umiddelbart anvendelige i mange cellebaserede applikationer. De protokoller, der præsenteres heri, til formål at gøre denne teknologi tilgængelig for forskningsverdenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De celler, der anvendes til dfTAT levering bør ikke være alt for sammenflydende (> 90% konfluens), da dette kan påvirke leveringen effektivitet. Cellerne skal også være sundt: døde celler i kulturen kan frigive apoptotiske fragmenter, som dfTAT kan interagere (f.eks DNA fra nedbrudte kerner). Dette kan forstyrre leveringen effektiviteten og kvaliteten af billedbehandling. Cellerne skal vaskes grundigt for at fjerne FBS, før du tilføjer dfTAT. BSA til stede i FBS kan binde til dfTAT og dette kan…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
Riferimenti
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
- Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
- Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
- Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
- Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
- Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
- Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
- Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
- Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
- Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
- Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).
