Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
Makromolekulare Lieferstrategien verwenden typischerweise die endozytischen Weg als Weg der zellulären Eintrag. Jedoch schränkt endosomalen Einschluß der Effizienz bei der Makromoleküle eine cytosolische Raum der Zellen einzudringen. Vor kurzem haben wir dieses Problem durch die Identifizierung der Reagenzien dfTAT, eine Disulfidbindung Dimer des Peptids TAT mit dem Fluorophor Tetramethylrhodamin markiert umgangen. Wir haben eine fluoreszenzmarkierte Dimer des prototypischen zellpenetrierende Peptid (CPP) TAT dfTAT, die lebende Zellen eindringt und erreicht den cytosolischen Raum von Zellen mit einem besonders hohen Wirkungsgrad erzeugt wird. Cytosolische Lieferung dfTAT in mehreren Zelllinien, einschließlich Primärzellen erreicht. Außerdem dauert die Lieferung nicht merklich beeinträchtigen die Lebensfähigkeit der Zellen, Proliferation oder Genexpression. dfTAT können kleine Moleküle, Peptide, Antikörper, biologisch aktive Enzyme und einen Transkriptionsfaktor zu liefern. In diesem Bericht beschreiben wir die Protokolle DfTa beteiligtT-Synthese und Zell Lieferung. Die Handschrift beschreibt, wie die Menge des Proteins an das cytosolische Raum der Zellen zugeführt, indem die Menge an Protein extrazellulär verabreicht steuern. Schließlich werden die jeweiligen Einschränkungen dieser neuen Technologie und Schritte bei der Validierung Lieferung beteiligt diskutiert. Die beschriebenen Protokolle sollten für zellbasierte Assays als auch für die ex vivo-Manipulation und Reprogrammierung von Zellen extrem nützlich sein.
Introduction
Die Verabreichung von Proteinen, Peptiden oder zell undurchlässigen kleinen Molekülen in lebende Zellen ist häufig bei vielen biologischen oder biotechnologischen Anwendungen (zelluläre Bildgebung, funktionelle Assays Reprogrammierung, etc.) 1-4 wünschenswert. Vielen Lieferansätze bereits berichtet wurden, einschließlich Mikroinjektion, Elektroporation oder Verwendung von Trägermitteln (z. B. zellpenetrierenden Peptide wie TAT, Lipide) 5-7. Jede Technik hat in der Regel spezifische Vor- und Nachteile, die diese Ansätze angemessen für bestimmte Anwendungen, aber nicht für andere machen könnten. Häufige Probleme beinhalten schlechte Lieferung Effizienzen und / oder Mangel an Kontrolle, wie viel Material 8,9 geliefert, Toxizität oder nachteilige physiologische Auswirkungen 10,11, mangelnde zeitliche Kontrolle, Lieferung in wenigen Zellen, nicht aber in einer Gesamtbevölkerung (z. B. Mikroinjektion) 12, und komplexe chemische Konjugation oder Formulierungssysteme 11.
<p clas s = "jove_content"> Kürzlich haben wir einen neuen Liefer Strategie, die diese Einschränkungen umgeht entwickelt. Diese Strategie stützt sich auf ein Peptid mit dem Namen dfTAT (Dimer Fluoreszenz TAT) 13. dfTAT wird aus der gut bekannten zellpenetrierenden Peptid (CPP) TAT abgeleitet. dfTAT enthält zwei disulfidgebundenen Kopien TAT mit dem Fluorophor Tetramethylrhodamin markiert. Trotz ihrer Ähnlichkeiten, TAT und dfTAT unterscheiden sich erheblich in der Aktivität. TAT wird typischerweise durch Endozytose in die Zellen internalisiert. Das CPP bleibt jedoch meist innerhalb Endosomen gefangen (dies in der Regel auf eine punktförmige Verteilung des Peptids in Zellen führen, wenn durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht). Wie TAT wird dfTAT effizient von Zellen Endozytose. Allerdings bedeutet dfTAT nicht in Endosomen gefangen zu bleiben. Stattdessen vermittelt es endosomalen Leckage in einer Weise, die sehr effizient ist. Die endosomolytische Aktivität dfTAT können dann genutzt werden, um Makromoleküle durch eine einfache Inkubation Assay zu liefern. ntent "> Das aktuelle Verständnis der Lieferprozess ist wie folgt. dfTAT induziert Makropinozytose. Dadurch Zellen mit dfTAT inkubiert nehmen lösliche Proteine, Peptide oder kleine Moleküle (Moleküle von Interesse, MOI) in Medien präsent durch Flüssigkeitsphasen- Endozytose (siehe Abbildung 1). Die Wechselwirkungen zwischen dfTAT und MOI sind nicht erforderlich, solange beide Entitäten Verkehr zusammen im endocytischen. Wie dfTAT erreicht eine bestimmte Schwelle im Lumen endozytischen Organellen, ihre endosomalen Leckageaktivität (die molekularen Details ausdrückt bleiben werden vollständig charakterisiert). Der Inhalt des Lumens leaky Organellen und damit die MOI, wird dann in den Zellen freigesetzt wird. Dieser Ansatz ist daher sehr praktisch, da keine Konjugation oder Zubereitung Schemata mit MOI erforderlich. Da außerdem dfTAT ist nicht direkt Modifizieren einer MOI, sollte es auch nicht mit MOIs Funktion stören, wenn intrazelluläre Abgabe erreicht wird. Darüber hinaus ist die Konzentration vondfTAT verwendet Lieferung ist unabhängig von jenem des Innenministeriums in Medien. Zum Beispiel kann dfTAT Konzentration zwischen verschiedenen Versuchen konstant gehalten wird, um reproduzierbare Effizienzen in endosomalen Leckage zu gewährleisten. Im Gegensatz dazu kann die Konzentration des MOI in Medien allmählich geändert werden, um gewünschte Niveaus erreichen MOI in Cytosol abgegeben.Die hohe Effizienz bei der endosomalen Leck dfTAT erreicht ist bemerkens unschädlich, viele der Zellen, die bisher getestet. Das ist eine Überraschung, weil endozytischen Organellen sind wichtiger Bestandteil der Zellen und würde man erwarten, dass die dramatische Leckage durch dfTAT vermittelt würden von schädlichen Zellreaktionen begleitet werden. Doch behandelten Zellen vermehren sich mit der gleichen Geschwindigkeit wie unbehandelte Zellen und keine wesentlichen Veränderungen in ihrem Transkriptom anzuzeigen. Darüber hinaus können innerhalb von Minuten mit reproduzierbaren Abgabeeffizienzen wiederholt werden, was darauf hinweist, dass die Zellen entweder toleriert oder erholen sich von den Lieferprozess ohne Verlustihre Fähigkeit zur Endozytose oder endosomalen Leckage. Subtile zellulären Reaktionen während dfTAT Lieferung und die molekularen Details, was diese Reaktionen könnte bleiben, erkundet zu werden werden stattfinden könnte. Doch durch das hohe Wirtschaftlichkeit, Bequemlichkeit der Protokolle, und das Fehlen von Toxizität, diese Lieferansatz sofort in vielen zellbasierten Anwendungen als nützlich erweisen. Die hier angegebenen Protokollen arbeiten daran, dass diese Technologie zugänglich zu der Forschungsgemeinschaft ausgerichtet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die zur dfTAT Lieferung verwendet wird, sollte nicht übermäßig sein konfluenten Zellen (> 90% Konfluenz), da dies die Abgabeeffizienz beeinflussen könnten. Die Zellen sollten auch gesund sein: toten Zellen in der Kultur kann apoptotischen Fragmente mit dem dfTAT können (zB DNA aus degradierten Kerne) interagieren, zu lösen. Dies wiederum kann mit der Lieferung Effizienz und die Qualität der Bildgebung stören. Zellen sollten gründlich gewaschen werden, um FBS zu entfernen, bevor dfTAT. BSA vorhanden …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
Riferimenti
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