משלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות Cell-חדיר לתאים חיים על ידי דגירה עם Endosomolytic מגיב dfTAT
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
אסטרטגיות משלוח macromolecular בדרך כלל לנצל את מסלול endocytic כתוואי כניסה סלולרית. עם זאת, מלכוד endosomal מגביל מאוד את היעילות שבה מולקולות גדולות לחדור את מרחב cytosolic של תאים. לאחרונה, יש לנו לעקוף בעיה זו על ידי זיהוי מגיב dfTAT, קשר דיסולפיד דימר של תאת פפטיד שכותרתו עם tetramethylrhodamine fluorophore. יש לנו נוצר דימר כותרתו fluorescently של תאת הטיפוסית פפטיד חודר תאים (CPP), dfTAT, שחודר לתאים חיים, ומגיע לחלל cytosolic של תאים עם יעילות גבוהה במיוחד. משלוח cytosolic של dfTAT מושגת בשורות תאים מרובות, כוללים תאים ראשוניים. יתר על כן, משלוח אינו ניכר להשפיע על כדאיויות תא, התפשטות או ביטוי גנים. dfTAT יכול לספק מולקולות, פפטידים, נוגדנים, אנזימים פעילים ביולוגי קטנים וגורם שעתוק. בדו"ח זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים מעורבים בdfTAסינתזת T ומשלוח סלולארי. כתב היד מתארת כיצד לשלוט בכמות החלבון שנמסר למרחב cytosolic של תאים על ידי שינוי כמות החלבון מנוהלת extracellularly. לבסוף, המגבלות הנוכחיות של הטכנולוגיה החדשה הזו והשלבים כרוכים באימות משלוח הם דנו. הפרוטוקולים תיארו צריכים להיות מאוד שימושיים עבור מבחני מבוססי תאים, כמו גם למניפולצית vivo לשעבר ותכנות מחדש של תאים.
Introduction
המשלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות תא חדיר לתאים חיים הוא לעתים קרובות רצוי ביישומים רבים ביולוגיים או ביוטכנולוגי (הדמיה סלולרית, מבחני פונקציונליים, תכנות מחדש של תאים, וכו '.) 1-4. גישות משלוח רבות כבר דווחו, כולל microinjection, electroporation, או שימוש בסוכנים מובילים (לדוגמא., פפטידים חודרים תאים כגון TAT, שומנים) 5-7. כל טכניקה יש בדרך כלל יתרונות וחסרונות ספציפיים שעשויה להפוך את הגישות אלה מתאימים ליישומים מסוימים אך לא לאחרים. בעיות נפוצות כרוכות יעילות ירודה משלוח ו / או חוסר שליטה של כמה חומר מועבר 8,9, רעילות או השפעה פיזיולוגית מזיקה 10,11, חוסר שליטה זמנית, משלוח בכמה תאים, אך לא בכל אוכלוסייה (למשל., תוכניות microinjection) 12, ונטייה כימית מורכבת או ניסוח 11.
<p clas = "Jove_content" של> לאחרונה, פיתחנו אסטרטגית משלוח רומן שעוקפת את המגבלות הללו. אסטרטגיה זו מסתמכת על פפטיד בשם dfTAT (דימר TAT ניאון) 13. dfTAT נגזר מפפטיד חודר התאים היטב יודעים (CPP) TAT. dfTAT מכיל שני עותקי דיסולפיד ערובה של תאת שכותרתו עם tetramethylrhodamine fluorophore. למרות דמיונם, תאת וdfTAT שונה באופן משמעותי בפעילות. תאת מופנמת בדרך כלל לתאים על ידי אנדוציטוזה. זה CPP נשאר עם זאת בעיקר לכוד בתוך endosomes (זה בדרך כלל יוביל להפצת punctate של פפטיד בתוך תאים כאשר נבדקו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי). כמו TAT, dfTAT הוא endocytosed ביעילות על ידי תאים. עם זאת, dfTAT לא להישאר לכוד בתוך endosomes. במקום זאת, הוא מתווך דליפת endosomal באופן שהוא יעיל מאוד. פעילות endosomolytic של dfTAT אז ניתן לנצל כדי לספק מקרומולקולות על ידי assay דגירה פשוט. ntent "> ההבנה הנוכחית של תהליך המשלוח היא כדלקמן. dfTAT גורם macropinocytosis. כתוצאה מכך, התאים הודגרו עם dfTAT לקחת את החלבונים מסיסים, פפטידים, או מולקולות קטנות (מולקולות של עניין, משרד הפנים) נוכחים בתקשורת על ידי נוזל-שלב אנדוציטוזה (ראה איור 1). אינטראקציות בין dfTAT ומשרד הפנים אינן נחוצות עוד שני ישויות התנועה יחד במסלול endocytic. כdfTAT מגיע לסף מסוים בתוך לומן של האברונים endocytic, הוא מבטא פעילות דליפת endosomal (פרטים המולקולריים להישאר להיות מאופיין במלואו). התוכן של לומן של האברונים דולפים, ולכן משרד הפנים, הוא שוחרר לאחר מכן לתאים. גישה זו היא אפוא מאוד נוחה כמו שאף תוכניות נטיה או ניסוח עם משרד הפנים נדרשות. יתר על כן, כי dfTAT הוא לא שינוי ישיר של משרד הפנים, הוא צריך גם לא להפריע לתפקוד MOIs פעם משלוח תאיים מושגת. בנוסף, הריכוזdfTAT משמש משלוח הוא עצמאי מזה של משרד הפנים בתקשורת. לדוגמא, ריכוז dfTAT יכול להישמר מתמיד בין ניסויים שונים כדי להבטיח יעילות לשחזור בדליפת endosomal. לעומת זאת, ריכוז של משרד הפנים בתקשורת ניתן לשנות בהדרגה כדי להשיג רמות רצויות של משרד הפנים נמסרו בcytosol.יעילות דליפת endosomal הגבוהה שהושגה עם dfTAT להפליא מזיקה לרב של התאים שנבדקו עד כה. זו הפתעה כי האברונים endocytic הם מרכיב חשוב של התאים וניתן היה לצפות כי הדליפה הדרמטית בתיווך dfTAT תהיה מלווה תגובות הסלולר מזיקות. עם זאת, תאים שטופלו להתרבות באותו קצב כמו תאים שלא טופלו ולא להציג כל שינוי משמעותי בtranscriptome. יתר על כן, משלוח ניתן לחזור תוך דקות עם יעילות משלוח לשחזור, מצביע על כך שתאים יכולים גם לסבול או להתאושש מתהליך הלידה מבלי לאבדהיכולת שלהם לאנדוציטוזה או דליפת endosomal. תגובות הסלולר עדינות עלולות להתרחש במהלך לידת dfTAT והפרטים המולקולריים של מה התגובות הללו עשויות להיות להישאר כדי להיחקר. ובכל זאת, על ידי שילוב של יעילות גבוהה, נוחות של פרוטוקולים, וחוסר הרעילות, גישת משלוח זה צריכה להוכיח מייד שימושית ביישומים מבוססי תאים רבים. הפרוטוקולים שהוצגו במסמך זה נועדו הפיכת טכנולוגיה זו נגישה לקהילת המחקר.
Protocol
Representative Results
Discussion
התאים המשמשים למשלוח dfTAT לא צריך להיות יותר מדי מחוברות (> confluency 90%) מאז זה עשויים להשפיע על יעילות המשלוח. התאים צריכים להיות גם בריאים: תאים מתים בתרבות יכולים לשחרר ברים אפופטוטיים עם שdfTAT יכול לקיים אינטראקציה (לדוגמא, ה- DNA מגרעינים מושפלים). זה בתורו יכול להפר…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
Riferimenti
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
- Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
- Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
- Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
- Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
- Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
- Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
- Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
- Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
- Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
- Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).
