Descriviamo come fornire proteine e piccole molecole impermeabili alle cellule di mammifero in coltura mediante un semplice protocollo di co-incubazione con un reagente che causa la perdita di organelli endocitici.
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Articolo metodologico
Consegna di proteine, peptidi o cella-impermeabile piccole molecole in cellule vive mediante incubazione con il reagente Endosomolytic dfTAT
In questo articolo
Sommario
Abstract
Strategie di consegna macromolecolari in genere utilizzano il percorso endocitica come una via di ingresso cellulare. Tuttavia, endosomal intrappolamento limita fortemente l'efficienza con cui macromolecole penetrare il locale citosolico di cellule. Recentemente, abbiamo aggirato il problema individuando il reagente dfTAT, un dimero legame disolfuro della TAT peptide marcato con il fluoroforo tetrametilrodamina. Abbiamo generato un dimero fluorescente della cellula-penetrante peptide (CPP) TAT prototipo, dfTAT, che penetra cellule vive e raggiunge lo spazio citosolico di cellule con una particolarmente alta efficienza. Consegna citosolico di dfTAT è raggiunto in linee cellulari multiple, comprese le cellule primarie. Inoltre, la consegna non influisce notevolmente la vitalità cellulare, la proliferazione e l'espressione genica. dfTAT in grado di fornire piccole molecole, peptidi, anticorpi, enzimi biologicamente attivi e un fattore di trascrizione. In questo rapporto, si descrivono i protocolli coinvolti nella DFTASintesi T e consegna cellulare. Il manoscritto descrive come controllare la quantità di proteine consegnato allo spazio citosolico di cellule variando la quantità di proteina somministrata extracellulare. Infine, gli attuali limiti di questa nuova tecnologia e passaggi necessari per la validazione di consegna sono discussi. I protocolli descritti devono essere estremamente utili per saggi cellulari e per la manipolazione ex vivo e riprogrammazione delle cellule.
Introduzione
La consegna di proteine, peptidi o piccole molecole cellulari impermeabili in cellule vive è spesso desiderabile in molte applicazioni biologiche o biotecnologiche (di imaging cellulare, test funzionali, riprogrammazione cellulare, ecc.) 1-4. Molti approcci di consegna sono già stati segnalati, tra cui la microiniezione, elettroporazione, o l'uso di agenti portanti (ad es., Peptidi cellule penetrante, come TAT, lipidi) 5-7. Ogni tecnica ha tipicamente pro e contro specifici che potrebbero rendere questi approcci adeguati per determinate applicazioni, ma non per gli altri. Problemi comuni riguardano l'efficienza di conse....
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Protocollo
1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Sintesi
Nota: dfTAT viene prodotta in due fasi: sintesi del monomero da fTAT solida sintesi del peptide fase seguita da disolfuro dimerizzazione legame per formare dfTAT.
- Swell 500 mg di pista di ammide resina MBHA in dimetilformammide (DMF) in una da 50 ml SPPS nave standard per 1 ora.
- Eseguire Fmoc deprotezione incubando resina protetto Fmoc in una soluzione di piperidina 20% (20% piperidina in DMF, 10 ml (0.30 mmoli). Eseguire i punti deprotezione doppio (1 x 5 min e 1 x 15 min) con una fase di lavaggio usando DMF (la fase di lavaggio comprende risciacquo resina più volte con un volume....
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Risultati
Per valutare la differenza tra fTAT e dfTAT, cellule HeLa sono incubate per 1 ora con ogni peptide per determinare la differenza nella loro localizzazione cellulare. L'internalizzazione dei due CPP del è stata valutata utilizzando la microscopia a fluorescenza. La figura 2 mostra che fTAT (20 micron) localizza in una distribuzione puntata. Questa distribuzione è coerente con il peptide rimanendo intrappolata all'interno endosomi. Al contrario, il segnale di fluorescenza di dfTAT (5 mM) mostra un.......
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Discussione
Le cellule utilizzate per la consegna dfTAT non dovrebbe essere eccessivamente confluenti (> 90% di confluenza), poiché questo potrebbe influenzare l'efficienza di consegna. Le cellule dovrebbero anche essere in buona salute: le cellule morte nella cultura possono rilasciare frammenti apoptotici con cui dfTAT può interagire (ad esempio, il DNA dai nuclei degradate). Questo a sua volta può interferire con efficienza di consegna e la qualità delle immagini. Le cellule devono essere lavati accuratamente per.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo articolo è stato supportato dal premio numero R01GM087227 dal National Institute of General Medical Sciences, dal Norman Ackerman Advanced Research Program e dalla fondazione Robert A. Welch (Grant A-1769).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Eparina | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blu | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Verde | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cisteina | Hyclone | Ordine speciale | |
| Aminoacidi protetti da Fmoc | Novabiochem | ||
| dfTAT | I campioni saranno forniti su richiesta (contatto: pellois@tamu.edu) | ||
| Cabina di | |||
| Microscopio a epifluorescenza invertita | Olympus | modello IXB1 | dotato di un tavolino di riscaldamento mantenuto a 37 gradi C e con una telecamera Rolera-MGI Plus retroilluminata con dispositivo ad accoppiamento di carica a moltiplicazione di elettroni (EMCCD) (Qimaging). |
| 37 gradi C umidificato, 5% CO2 incubatore | |||
| Sintetizzatore di peptidi o recipiente per preformare la sintesi |
Riferimenti
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Del....
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Ristampe e permessi
