Levering av proteiner, peptider eller celle-ugjennomtrengelig små molekyler inn i levende celler ved inkubasjon med den Endosomolytic Reagens dfTAT
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
Macromolecular levering strategier vanligvis utnytte endocytoseveien som en rute av mobilnettet oppføring. Men endosomale entrapment sterkt begrenser effektiviteten som makromolekyler trenge gjennom cytosolisk plass av celler. Nylig har vi omgå dette problemet ved å identifisere reagensen dfTAT, en disulfidbinding dimer av peptidet TAT merket med fluorofor tetramethylrhodamine. Vi har generert en fluorescensmerket dimer av det prototypiske celle-gjennomtrengende peptid (CPP) TAT, dfTAT, som trenger inn i levende celler, og når den cytosoliske plass av celler med en spesielt høy effektivitet. Cytosoliske levering av dfTAT oppnås i flere cellelinjer, inkludert primære celler. Videre betyr levering ikke merkbart påvirke cellenes levedyktighet, spredning eller genuttrykk. dfTAT kan levere små molekyler, peptider, antistoffer, biologisk aktive enzymer og en transkripsjonsfaktor. I denne rapporten beskriver vi protokollene involvert i dfTAT syntese og cellulær levering. Manuskriptet beskriver hvordan du styrer mengden protein levert til cytosolic plass av celler ved å variere mengden protein administreres ekstracellulært. Endelig er de aktuelle begrensninger av denne nye teknologien og trinnene involvert i å validere levering diskutert. De beskrevne protokollene bør være svært nyttig for cellebaserte analyser, så vel som for ex vivo manipulering og omprogrammering av celler.
Introduction
Levering av proteiner, peptider eller celle ugjennomtrengelig små molekyler i levende celler er ofte ønskelig i mange biologiske eller bioteknologiske applikasjoner (mobil bildebehandling, funksjonelle analyser, cellular omprogrammering, osv.) 1-4. Mange leverings tilnærminger har allerede blitt rapportert, inkludert mikroinjeksjon, elektroporering, eller bruk av bærermidler (f.eks., Cellepenetrerende peptider slik som TAT, lipider) 5-7. Hver teknikk vanligvis har spesifikke fordeler og ulemper som kan gjøre disse tilnærmingene tilstrekkelig for enkelte programmer, men ikke for andre. Vanlige problemer bære dårlig levering effektivitet og / eller manglende kontroll med hvor mye materiale er levert 8,9, giftighet eller skadelige fysiologisk innvirkning 10,11, mangel på time kontroll, levering i noen få celler, men ikke i en hel befolkning (f.eks., mikroinjeksjon) 12, og kompleks kjemisk konjugering eller formulerings ordninger 11.
<p clas s = "jove_content"> Nylig har vi utviklet en ny levering strategi som omgår disse begrensningene. Denne strategien er avhengig av et peptid heter dfTAT (dimer fluorescerende TAT) 13. dfTAT er avledet fra det godt kjent celle-gjennomtrengende peptid (CPP) TAT. dfTAT inneholder to disulfid-bundet kopier av TAT merket med fluorofor tetramethylrhodamine. Til tross for sine likheter, TAT og dfTAT signifikant forskjellig i aktivitet. TAT er vanligvis internalisert inn i cellene ved endocytose. Dette CPP forblir imidlertid det meste fanget inne endosomes (dette vanligvis føre til en punktformet fordeling av peptidet inni cellene ved undersøkelse av fluorescens mikroskopi). Som TAT, er dfTAT effektivt gjennom endocytose av celler. Men det betyr dfTAT ikke bli fanget inne endosomes. I stedet, medierer den endosomale lekkasje på en måte som er meget effektiv. Den endosomolytic aktivitet av dfTAT kan da utnyttes for å levere makromolekyler ved en enkel inkubasjon assay. ntent "> Den nåværende forståelse av leveringsprosessen er som følger. dfTAT induserer macropinocytosis. Som et resultat av celler inkubert med dfTAT ta opp løselige proteiner, peptider eller små molekyler (molekyler av interesse, MOI) som er tilstede i mediene av væskefase endocytose (se figur 1). Interaksjoner mellom dfTAT og MOI er ikke nødvendig så lenge som begge enheter trafikk sammen i endocytoseveien. Som dfTAT når en viss terskelverdi i lumen av endocytiske organeller, uttrykker den sin endosomale lekkasje aktivitet (de molekylære detaljer gjenstår å bli fullstendig karakterisert). Innholdet i lumen av utett organeller, og derfor MOI, blir deretter sluppet inn i cellene. Denne fremgangsmåten er derfor meget praktisk da det ikke konjugering eller formulerings ordninger med MOI er nødvendig. Dessuten, fordi dfTAT er ikke direkte å modifisere en MOI, bør det heller ikke forstyrre mois funksjon når intracellulær levering oppnås. I tillegg er konsentrasjonen avdfTAT brukt levering er uavhengig av at av MOI i media. For eksempel kan dfTAT konsentrasjonen holdes konstant mellom forskjellige eksperimenter for å sikre reproduserbare effektivitet i endosomale lekkasje. I kontrast, kan konsentrasjonen av MOI i media bli gradvis endret for å oppnå ønskede nivåer av MOI levert i cytosol.Den høye endosomale lekkasje effektivitet oppnås med dfTAT er bemerkelsesverdig ufarlige til mange av cellene testet til dags dato. Dette er et overraskende fordi endocytiske organeller er viktige bestanddel av cellene, og man ville forvente at den dramatiske lekkasje mediert av dfTAT ville bli ledsaget av skadelige, cellulære responser. Likevel, behandlede celler spre i samme takt som ubehandlede celler og viser ikke noen vesentlige endringer i deres transkriptom. Videre kan levering bli gjentatt i løpet av minutter med reproduserbare levering effektivitet, noe som indikerer at cellene kan enten tolerere eller gjenopprette fra leveringsprosessen uten å mistederes evne til endocytose eller endosomale lekkasje. Subtile cellulære responser kan skje i løpet dfTAT levering og de molekylære detaljene av hva disse svarene kan være å bli utforsket. Likevel, ved å kombinere høy effektivitet, bekvemmelighet av protokoller, og mangel på toksisitet, bør dette arrangementet tilnærmingen vise seg umiddelbart nyttig i mange cellebaserte applikasjoner. Protokollene som presenteres her, er rettet mot å gjøre denne teknologien tilgjengelig for forskersamfunnet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellene som brukes for levering dfTAT bør ikke være altfor sammenflytende (> 90% konfluens), siden dette kan påvirke leveringseffektiviteten. Cellene skal også være sunt: døde celler i kultur kan frigi apoptotiske fragmenter som dfTAT kan samhandle (for eksempel DNA fra nedbrutte kjerner). Dette i sin tur kan påvirke leveringen effektiviteten og kvaliteten av imaging. Cellene må vaskes grundig for å fjerne FBS før du legger dfTAT. BSA tilstede i FBS kan binde seg til dfTAT, og dette kan redus…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
Riferimenti
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
- Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
- Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
- Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
- Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
- Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
- Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
- Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
- Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
- Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
- Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).
