Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

Summary

La spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF MS) e le tecniche molecolari (sequenziamento genico dell'rRNA 16S) consentono l'identificazione di patogeni batterici rari nella diagnostica di routine. L'obiettivo di questo protocollo risiede nella combinazione di entrambe le tecniche che porta a dati più accurati e affidabili.

Abstract

Ci sono un certo numero di batteri patogeni rare e, quindi, non sufficientemente descritto che sono riportati per causare infezioni gravi specialmente nei pazienti immunocompromessi. Nella maggior parte dei casi solo pochi dati, per lo più pubblicati come case report, sono disponibili che indagare il ruolo di tali agenti patogeni come un agente infettivo. Pertanto, al fine di chiarire il carattere patogeno di tali microrganismi, è necessario condurre studi epidemiologici che comprendono un gran numero di questi batteri. I metodi utilizzati in uno studio tale sorveglianza devono soddisfare i seguenti criteri: l'identificazione dei ceppi deve essere accurata secondo la nomenclatura valida, dovrebbero essere facili da maneggiare (robustezza), economico nella diagnostica di routine e devono generare comparabili risultati tra i diversi laboratori. In generale, ci sono tre strategie per l'identificazione di ceppi batterici in un ambiente di routine: 1) Identificazione fenotipica che caratterizza la BioChemicaL e metaboliche proprietà dei batteri, 2) tecniche di biologia molecolare, come 16S rRNA sequenziamento del gene e 3) spettrometria di massa come un approccio basato romanzo proteoma. Poiché spettrometria di massa e approcci molecolari sono gli strumenti più promettenti per identificare una grande varietà di specie batteriche, sono descritti questi due metodi. I progressi, limitazioni e potenziali problemi quando si utilizzano queste tecniche sono discusse.

Introduction

l'identificazione sicura dei patogeni rari nella diagnostica di routine è ostacolata dal fatto che i metodi culturali e biochimici classici sono ingombranti e talvolta discutibili. Inoltre, un laboratorio di microbiologia diagnostica deve elaborare un gran numero di agenti patogeni, che vanno da poche centinaia a diverse migliaia, giornaliero, che richiede l'uso di sistemi automatizzati. Oltre alla gestione di una elevata produttività giornaliera, è necessaria la precisa identificazione di specie batteriche. Questo è giustificato dal momento che si differenziano per il loro modello di sensibilità agli antibiotici e, pertanto, la corretta identificazione forni....

Protocol

1. Estrazione del DNA batterico

1. Preparazione della Soluzione PBS
   1. Pesare 1,65 g di Na ₂ HPO ₄ x 2H ₂ O, 0,22 g di NaH ₂ PO ₄ x 2H ₂ O e 8,80 g di NaCl in un pallone e riempire con acqua distillata fino ad un volume finale di 1000 ml. Regolare il pH a 7,4. Per l'uso finale filtrare la soluzione attraverso un batterio a prova (0,22 micron) Filtro.
2. I batteri DNA Estrazione di Gram-negativi
   1. Streak il materiale del paziente su terreni di coltura appropriato (ad esempio, Columbia agar sangue), identificare ed isolare potenziali patogeni.
   2. ....

Results

MALDI-TOF MS è un romanzo, metodo veloce ed economico per la diagnostica di routine microbiologici. Batterica identificazione della specie da MALDI-TOF MS produce spettri principalmente composto da proteine ​​ribosomali, ma anche altri "proteine ​​molto conservato con funzioni di house-keeping colpite in misura minima dalle condizioni ambientali" ¹⁷ banca dati .La di questa MMIS contiene un grande insieme di spettri di riferimento e anche i batteri, che raramente si trovano in.......

Discussion

Entrambi MALDI-TOF MS e 16S rRNA gene sequenziamento offrono la possibilità di individuare un gran numero di batteri diversi. MALDI-TOF MS è un metodo veloce ed economico, che è facile da maneggiare e grandi database di spettri di massa batterica sono disponibili. Per questo motivo, MALDI-TOF MS è un metodo efficace e affidabile rapida costo per condurre studi di screening focalizzati in rare batteri patogeni ^17,20,39,51. In uno studio prospettico confrontando MALDI-TOF MS con altri metodi di identificazione .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHROMASOLV, acqua per HPLC, 1 L	Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, Germania	270733
Lyser tissutale LT	Qiagen, Hilden, Germania	85600	Omogeneizzatore oscillante
Perle di vetro 1,0 mm	VWR International, Darmstadt, Germania	412-2917
Termomiscelatore 5436	Eppendorf, Amburgo, Germania	2050-100-05
Kit QIAamp DNA Mini (250)	Qiagen, Hilden, Germania	51306
Kit di base Taq PCR (1.000 U)	Qiagen, Hilden, Germania	201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')	biomers.net, Ulm, Germania	-
Primer inverso RTU4 (5&acuto;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´)	biomers.net, Ulm, Germania	-
Mastercycler	Eppendorf, Amburgo, Germania	-	Termocilcero
Provetta di reazione 1,5 ml	SARSTEDT, Nü mbrecht, Germania	72.692
Provetta di reazione 2 ml	SARSTEDT, Nü mbrecht, Germania	72.693.005
PCR 8er-CapStrips	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germania	711040X
PCR 8er-SoftStrips	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germania	711030X
Sharp R-ZV11	Sharp Electronics, Amburgo,	Germania-Microonde
Titriplex III (EDTA Na2-sale disidratato; 1 kg)	Merck, Darmstadt, Germania	1084211000
SeaKem LE Agarose	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germania	849006
SmartLadder SF - da 100 a 1.000 bp	Eurogentec, Lü ttich, Belgio	MW-1800-04
Blu di bromofenolo (25 g)	Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, Germania	B0126
Xilene cianolo FF (10 g)	Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, Germania	X4126
ComPhor L Maxi	Biozym, Hessisch Oldendorf,	Germania-Soluzione
bromuro di etidio 1% (10 ml)	Carl Roth, Karlsruhe, Germania	2218.1
Gel Doc 2000	Bio-Rad Laboratories, Mü nchen,	Germania-Sistema	di documentazione in gel
ExoSAP-IT (500 reazioni)	Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Regno Unito	78201
Tampone (10x) con EDTA	Life Technologies, Darmstadt, Germania	402824
BigDye Terminator Kit v1.1	Life Technologies, Darmstadt, Germania	4337450
Hi-Di formamide (25 ml)	Life Technologies, Darmstadt, Germania	4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)	Qiagen, Hilden, Germania	63206
3130 Analizzatore genetico	Life Technologies, Darmstadt, Germania	-	Sequenziatore
MicroAmp piastra di reazione ottica a 96 pozzetti con codice a barre	Life Technologies, Darmstadt, Germania	4306737
3130 Genetic Analyzer, base su piastra a 96 pozzetti	Life Technologies, Darmstadt, Germania	4317237
3130 Genetic Analyzer, fermo per piastre a 96 pozzetti	Life Technologies, Darmstadt, Germania	4317241
3130 Genetic Analyzer, pozzetto septa a piastre	Life Technologies, Darmstadt, Germania	4315933
Analizzatore genetico 3130, polimero POP-7, 7 ml	Life Technologies, Darmstadt, Germania	4352759
, array a 4 capillari, 50 cm	Life Technologies, Darmstadt, Germania	4333466
	Life Technologies, Darmstadt, Germania	-
microflex	Bruker Daltonik, Brema,	Germania-Il	nostro mMIS
VITEK MS	bioMé rieux, Nü rtingen, Germania		2nd mMIS
flexControl 3.4	Bruker Daltonik, Brema,	Germania-Software	di controllo dei dispositivi
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)	Bruker Daltonik, Brema,	Germania-Software	di analisi
α-acido ciano-4-idrossicinnamico, HCCA, 1  g	Bruker Daltonik, Brema, Germania	201344
Peptide Calibration Standard II	Bruker Daltonik, Brema, Germania	222570
MSP 96 target acciaio lucido	Bruker Daltonik, Brema, Germania	8224989
peqGREEN	peqlab	37-5010
MALDI Biotyper Galaxy	Bruker Daltonik, Brema, Germania	Codice 1836007	Sistema automatizzato di preparazione dei campioni
Vitek 2	bioMé rieux, Nü rtingen, Germania		Il nostro aMIS
MicroScan	Beckman Coulter, Krefeld, Germania		2nd aMIS
BD Phoenix™ Sistema di microbiologia automatizzato	BD, Heidelberg, Germania		3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp.  aureus  Rosenbach (ATCC®   25923&commercio;)	American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, Francia		Controllo positivo per PCR