Identifisering av sjeldne bakterielle patogener av 16S rRNA Gene Sequencing og MALDI-TOF MS

Summary

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Abstract

Det finnes en rekke sjeldne og derfor utilstrekkelig beskrevet bakterielle patogener som er rapportert å forårsake alvorlige infeksjoner, spesielt i immunkompromitterte pasienter. I de fleste tilfeller bare få data, hovedsakelig publisert som kasuistikker, er tilgjengelig som undersøke hvilken rolle slike patogener som en smittsom agent. Derfor, for å klargjøre den patogene karakter av slike mikroorganismer, er det nødvendig å gjennomføre epidemiologiske studier som omfatter et stort antall av disse bakteriene. Metodene som benyttes i en slik overvåkningsstudie må oppfylle følgende kriterier: identifikasjon av stammene må være nøyaktig i henhold til den gyldige nomenklatur, bør de være lette å håndtere (robusthet), økonomisk i rutinemessig diagnostikk, og de har til å generere tilsvar resultater mellom ulike laboratorier. Vanligvis er det tre strategier for å identifisere bakteriestammer i en rutine innstilling: 1) fenotypiske identifisering karakteriserer den Biochemical og metabolske egenskaper av bakterier, 2) molekylære teknikker som for eksempel 16S rRNA-genet sekvensering og 3) massespektrometri som en ny proteom- basert metode. Siden massespektrometri og molekylære tilnærminger er et viktig verktøy for å identifisere et stort utvalg av bakteriearter, er disse to metodene beskrevet. Fremskritt, begrensninger og potensielle problemer ved bruk av disse teknikkene er diskutert.

Introduction

Sikker identifikasjon av sjeldne patogener i rutinemessig diagnostikk er hemmet av det faktum at de klassiske kulturelle og biokjemiske metoder er tungvinte og ofte tvilsom. Videre har et diagnostisk mikrobiologiske laboratorier for å behandle et stort antall patogener, som strekker seg fra noen få hundre til flere tusen, daglig, noe som krever bruk av automatiserte systemer. I tillegg til forvaltningen av et høyt daglig gjennomstrømning, er presis identifisering av bakteriearter nødvendig. Dette er garantert, siden de har ulik antimikrobiell resistensmønster og derfor riktig identifisering gir klinikeren med viktig informasjon for å velge egnede antibiotika (f.eks Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) ^12,43.

Automatiserte mikrobielle identifikasjonssystemer (AMIS) gjelder standardiserte sett med enzymatiske reaksjoner for å karakterisere de metabolske egenskaper bakterieisolater <sup> 13,15,16,26,27. Selv om patronene som brukes i disse systemer benytter et stort antall forskjellige biokjemiske reaksjoner, for eksempel, 47 i GN-kort av den Amis brukt i denne studien ^52, denne strategi tillater sikker identifisering kun for et begrenset sett av bakterier. Videre er database, en avansert ekspert system, tydelig fokusert på deteksjon av relevante og svært relevante bakterier av medisinsk betydning ^13,15,16,36. Ytterligere to systemer, mye brukt i laboratorier, gjelder også denne biokjemiske tilnærmingen for bakteriell identifikasjon. Nyere studier viser en tilsvarende identifikasjon nøyaktighet mellom AMIS brukt i denne studien og en av konkurrentene (93,7% og 93,0% henholdsvis), mens det ^3. AMIS har en identifikasjon nøyaktighet på bare 82,4% på artsnivå ^35. Slike avvik kan forklares med kvaliteten på de underliggende identifikasjon datareferanser, versjonene av kits og programvare, forskjeller i metaboLISM og ferdigheter av teknisk personell ^35,36.

To automatiserte MALDI-TOF MS-systemer (MALDI-TOF mikrobiell identifikasjon system, MMIs) er i hovedsak brukt. Disse systemene gir mulighet for deteksjon av et stort antall bakteriearter basert på deres protein fingeravtrykk massespektra. For eksempel inneholder databasen av MMIs anvendt 6000 referanse-spektra. Identifikasjonssystemer basert på massespektrometri tilby en rask og pålitelig deteksjon av et stort utvalg av mikroorganismer, inkludert sjeldne patogener ^11,48,51. Til dags dato bare noen direkte sammenligninger er tilgjengelig mellom MMIs brukt i denne studien og konkurrenten ^19,33. Ifølge dæk et al. Begge systemer gir en tilsvarende høy grad av identifikasjon nøyaktighet, men MMIs brukt i denne studien synes å være mer pålitelig i artsbestemmelse ^19.

Tilsvarende molekylære teknikker adressering godt bevart, men også forskjellige gener ( <em> f.eks 16S rDNA eller rpoB) tillate en klar identifisering av arter ^3,22,61. Blant disse, er den 16S rDNA den mest brukte husholdningsgenet på grunn av dens tilstedeværelse i alle bakterier ^34. Dens funksjon er uendret, og til slutt, med omtrent 1500 bp, det er lenge nok til å være egnet for bio-informatikk ^14,34. Mange forskere anser 16S rRNA-genet analyse som "gullstandard" for bakteriell identifikasjon ^21. Dette skyldes det faktum at noen få laboratorier bruke DNA-DNA-hybridiseringsteknikker til dags dato for identifisering av sjeldne eller nye bakterier ^14,34. I tillegg er flere og flere databaser er tilgjengelige som kan anvendes for 16S rRNA-genet analyse ^50. Imidlertid må det tas hensyn til at 16S rDNA baserte deteksjonssystemer har en begrenset sensitivitet i forhold til standard PCR protokoller. Videre er molekyl tilnærmingen sofistikerte, tidskrevende og krever høyt kvalifisert personell samtdedikerte laboratoriefasiliteter og er derfor ikke lett implementeres i rutinediagnostikk ^55. Videre har det blitt vist at en kombinasjon av minst to forskjellige fremgangsmåter for bakteriell identifikasjon fører til meget nøyaktig belastning identifikasjon. Kombinasjonen av MALDI-TOF MS og 16S rDNA-sekvensering tillater identifisering av et stort antall forskjellige bakteriearter med høy nøyaktighet. Nylig kombinasjonen av MALDI-TOF MS og 16S rRNA-genet analyse ble presentert for bakteriell identifikasjon studere epidemiologiske spørsmål og sjeldne patogener ^56.

Protocol

1. Utvinning av bakteriell DNA Fremstilling av PBS-oppløsning Veie 1,65 g Na HPO 2 4 x 2 H 2 O, 0,22 g NaH 2PO 4 x 2 H 2 O og 8,80 g NaCl i en kolbe og fylles med destillert vann til et sluttvolum på 1000 ml. Juster pH-verdien til 7,4. For endelig bruk filtrere oppløsningen gjennom et bakterietett (0,22 um) filter. DNA Utvinning av gram-negative bakterier Streak pasientmaterialet på riktig dyrkningsmedi…

Representative Results

MALDI-TOF MS er en roman, rask og billig metode for mikrobiologiske rutinediagnostikk. Bakteriell artsidentifikasjon av MALDI-TOF MS produserer spektra i hovedsak består av ribosomale proteiner, men også andre "svært konserverte proteiner med vaktmester funksjoner påvirkes i liten grad av miljøforhold" 17 sikret database med dette MMIs inneholder et stort sett med referanse spektra og selv bakterier som er sjelden funnet i kliniske isolater kan sikkert identifis…

Discussion

Både MALDI-TOF MS og 16S rRNA-genet sekvensering gir mulighet for å identifisere et stort antall forskjellige bakterier. MALDI-TOF MS er en rask og billig fremgangsmåte, som er lett å håndtere og store databaser med bakteriell massespektra er tilgjengelige. Av denne grunn er MALDI-TOF MS en rask, kostnadseffektiv og pålitelig metode for å gjennomføre screening studier fokusert på sjeldne bakterielle patogener ^17,20,39,51. I en prospektiv studie som sammenlignet MALDI-TOF MS med andre fenotypiske iden…

Materials

CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	270733
Tissue Lyser LT	Qiagen, Hilden, Germany	85600	Oscillating Homogenizer
Glass-beads 1,0mm	VWR International, Darmstadt, Germany	412-2917
Thermomixer 5436	Eppendorf, Hamburg, Germany	2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250)	Qiagen, Hilden, Germany	51306
Taq PCR Core Kit (1000 U)	Qiagen, Hilden, Germany	201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)	biomers.net GmbH, Ulm, Germany	–
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´)	biomers.net GmbH, Ulm, Germany	–
Mastercycler	Eppendorf, Hamburg, Germany	-	Thermocylcer
Reaction tube 1.5 mL	SARSTEDT, Nümbrecht, Germany	72,692
Reaction tube 2 mL	SARSTEDT, Nümbrecht, Germany	72,693,005
PCR 8er-CapStrips	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	711040X
PCR 8er-SoftStrips	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	711030X
Sharp R-ZV11	Sharp Electronics, Hamburg, Germany	–	Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg)	Merck, Darmstadt, Germany	1084211000
SeaKem LE Agarose	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	849006
(2 x 500 g)
SmartLadder SF – 100 to 1000 bp	Eurogentec, Lüttich, Belgium	MW-1800-04
Bromphenol blue (25 g)	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	B0126
Xylene cyanol FF (10 g)	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	X4126
ComPhor L Maxi	Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany	–
Ethidium bromide solution 1 %(10 mL)	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2218.1
Gel Doc 2000	Bio-Rad Laboratories, München, Germany	–	Gel-documentation system
ExoSAP-IT (500 reactions)	Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom	78201
Buffer (10 x) with EDTA	Life Technologies, Darmstadt, Germany	402824
BigDye Terminator Kit v1.1	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4337450
Hi-Di formamide (25 mL)	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)	Qiagen, Hilden, Germany	63206
3130 Genetic Analyzer	Life Technologies, Darmstadt, Germany	–	Sequenzer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mL	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4333466
Sequencing Analysis Software 5.4	Life Technologies, Darmstadt, Germany	–
microflex (the MALDI TOF MS maschine)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	–
MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	–	our mMIS
VITEK MS	bioMérieux, Nürtingen, Germany		2nd mMis
flexControl 3.4 (control software)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	–
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	–
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	201344
Peptide Calibration Standard II	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	222570
MSP 96 target polished steel	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8224989
peqgreen	peqlab	37-5010
MALDI Biotyper Galaxy	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	Part No. 1836007
Vitek 2	bioMérieux, Nürtingen, Germany		our aMis
MicroScan	Beckman Coulter		2nd aMis
BD Phoenix™ Automated Microbiology System	BD		3rd aMis
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™)	ATCC		postive control for PCR