JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Идентификация редких бактериальными патогенами с 16S рРНК секвенирование гена и MALDI-TOF MS

Published: July 11, 2016
doi:
10.3791/53176
, , ,
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus,TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus,TU Dresden

Summary

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Abstract

Есть целый ряд редких и, следовательно, недостаточно описаны бактериальных патогенов, которые, как сообщается, вызывают тяжелые инфекции, особенно у пациентов с иммунодефицитом. В большинстве случаев лишь немногие данные, в основном опубликованы в виде сообщений о случаях, доступны, которые исследовать роль таких патогенов, как инфекционного агента. Поэтому для того, чтобы прояснить патогенный характер таких микроорганизмов, необходимо проводить эпидемиологические исследования, которые включают в себя большое количество этих бактерий. Методы, используемые в таком исследовании наблюдения должны соответствовать следующим критериям: идентификация штаммов должно быть точным в соответствии с действующей номенклатуре, они должны быть просты в обращении (надежность), экономичны в рутинной диагностике, и они должны генерировать сопоставимы результаты среди разных лабораторий. Как правило, существует три стратегии для идентификации бактериальных штаммов, в обычной обстановке: 1) идентификация фенотипический характеризующий Biochemicaл и метаболические свойства бактерий, 2) молекулярные методы, такие как 16S рРНК секвенирование гена и 3) масс-спектрометрии в качестве подхода, основанного на романе протеома. Поскольку масс-спектрометрии и молекулярные подходы являются наиболее перспективными инструментами для выявления большое разнообразие видов бактерий, эти два метода описаны. Авансы, ограничения и потенциальные проблемы при использовании этих методов обсуждаются.

Introduction

Безопасная идентификация редких патогенов в рутинной диагностике мешает тот факт, что классические культурные и биохимические методы являются громоздкими и иногда сомнительна. Кроме того, диагностическая лаборатория микробиологии должен обрабатывать большое количество патогенных микроорганизмов, в пределах от нескольких сотен до нескольких тысяч, ежедневно, что требует использования автоматизированных систем. В дополнение к управлению большой суточной пропускной способности, точная идентификация видов бактерий необходим. Это оправдано , так как они отличаются по своей противомикробной шаблон восприимчивости и , следовательно , правильная идентификация обеспечивает клинициста с необходимой информацией , чтобы выбрать соответствующие антибиотики (например, Enterococcus SPP., Acinetobacter SPP.) 12,43.

Автоматизированные микробные системы идентификации (МАСС) применяются стандартные наборы ферментативных реакций охарактеризовать метаболические свойства бактериальных изолятов <sup> 13,15,16,26,27. Несмотря на то, что картриджи , используемые в этих системах используют большое количество различных биохимических реакций, например, 47 в GN карты МАСС , используемой в данном исследовании 52, это позволяет стратегии безопасной идентификации только для ограниченного набора бактерий. Кроме того, база данных, передовая экспертная система, четко сосредоточена на выявлении соответствующих и высоко соответствующих бактерий медицинского значения 13,15,16,36. Две другие системы, широко используемые в лабораториях, а также применять этот биохимический подход для идентификации бактерий. Недавние исследования демонстрируют сопоставимую точность идентификации между МАСС , используемых в данном исследовании , и один из конкурентов (93,7% и 93,0% соответственно), в то время как 3 – й МАСС имеет точность определения только 82,4% на уровне видов 35. Такие расхождения можно объяснить качеством основных ссылок идентификации данных, варианты комплектов и программного обеспечения, различия в MetaboЛМЗС и квалификация технического персонала 35,36.

в основном используются две автоматизированные системы MALDI-TOF MS (MALDI-TOF микробной системы идентификации, mMIS). Эти системы позволяют для обнаружения большого количества видов бактерий на основе их спектров отпечатку пальца белковой массы. Например, база данных содержит mMIS используемых 6000 эталонных спектров. Системы идентификации , основанные на масс – спектрометрии обеспечивают быстрое и надежное обнаружение самых разнообразных микроорганизмов , в том числе редких возбудителей 11,48,51. На сегодняшний день лишь несколько прямых сравнений доступны между mMIS , используемых в данном исследовании , и его конкурент 19,33. Согласно Dæk и др. Обе системы обеспечивают подобный высокий уровень точности идентификации, но mMIS , используемые в данном исследовании , представляется более надежным в идентификации видов 19.

Кроме того, молекулярные методы адресации хорошо законсервированные, но и отдельные гены ( <em> например, 16S рДНК или гроВ) позволяют четко идентифицировать видовой 3,22,61. Среди них 16S рДНК является наиболее широко используется ген домашнего хозяйства из – за его присутствия во всех бактерий 34. Его функция остается неизменной и , наконец, с примерно 1500 пар оснований , достаточно долго , чтобы быть пригодным для биоинформатики 14,34. Многие исследователи считают анализ гена 16S рРНК в качестве "золотого стандарта" для идентификации бактерий 21. Это связано с тем , что немногие лаборатории используют методы ДНК-ДНК гибридизации на сегодняшний день для выявления редких или новых бактерий 14,34. Кроме того, все больше и больше баз данных, доступных , которые могут быть использованы для анализа 50 гена 16S рРНК. Тем не менее, следует принимать во внимание, что системы обнаружения, основанные 16S рРНК имеют ограниченную чувствительность по сравнению со стандартными протоколами ПЦР. Кроме того, молекулярный подход сложный, отнимает много времени и требует высококвалифицированного персонала, а такжеспециализированные лабораторные помещения и, следовательно, не легко реализуется в рутинной диагностике 55. Кроме того, было показано, что комбинация по крайней мере, двух различных методов идентификации бактерий приводит к высоко точной идентификации штамма. Сочетание MALDI-TOF MS и 16S-рДНК секвенирования позволяет идентифицировать большое число различных видов бактерий с высокой точностью. Недавно было представлено сочетание анализа генов MALDI-TOF MS и 16S рРНК для идентификации бактерий изучения эпидемиологических вопросов и редких патогенных микроорганизмов 56.

Protocol

1. Выделение ДНК микобактерий Приготовление раствора PBS Взвешивают 1,65 г Na 2 HPO 4 х 2H 2 O, 0,22 г NaH 2 PO 4 × 2H 2 O и 8,80 г NaCl в колбу и заполнить дистиллированной водой до конечного объема 1000 мл. Доводят рН до 7,4. Для конечного использования фильтрации раст?…

Representative Results

MALDI-TOF MS является новым, быстрый и недорогой метод для микробиологических рутинной диагностики. Бактериальный идентификация видов путем MALDI-TOF MS производит спектры в основном состоит из рибосомных белков , но и других "очень консервативных белков с функциями дом по п…

Discussion

Оба MALDI-TOF MS и 16S рРНК секвенирование гена дают возможность идентифицировать большое количество различных бактерий. MALDI-TOF MS является быстрым и недорогим способом, который прост в обращении и большие базы данных бактериальных масс-спектров доступны. По этой причине, MALDI-TOF MS является быст?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Prof. Enno Jacobs for his continuing support.

Materials

CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating Homogenizer
Glass-beads 1,0mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net GmbH, Ulm, Germany  –
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net GmbH, Ulm, Germany  –
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 mL SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 mL SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany – Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
(2 x 500 g)
SmartLadder SF – 100 to 1000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromphenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany –
Ethidium bromide solution 1 %(10 mL) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany – Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10 x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 mL) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany – Sequenzer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mL Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany –
microflex (the MALDI TOF MS maschine) Bruker Daltonik, Bremen, Germany –
MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system) Bruker Daltonik, Bremen, Germany – our mMIS
VITEK MS  bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMis 
flexControl 3.4 (control software) Bruker Daltonik, Bremen, Germany –
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software) Bruker Daltonik, Bremen, Germany –
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqgreen  peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007 
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  our aMis 
MicroScan  Beckman Coulter  2nd aMis 
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD 3rd aMis 
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) ATCC  postive control for PCR 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. . . Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers – Getting Started Guide. , (2010).
  2. . Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers – Getting Started Guide. , 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17 (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49 (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79 (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521 (2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70 (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39 (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19 (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30 (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27 (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8 (4), e59491 (2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49 (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17 (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36 (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42 (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81 (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33 (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6 (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42 (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20 (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25 (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42 (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42 (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43 (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49 (12), 4412 (2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28 (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32 (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31 (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14 (1), 289 (2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70 (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18 (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33 (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45 (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). , (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80 (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45 (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288 (16), 1985 (2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51 (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46 (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67 (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. , (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21 (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6 (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. , (2014).
  52. Pincus, D. H., Miller, M. J. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. , 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19 (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15 (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095 (2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79 (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin’s lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50 (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42 (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52 (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory–pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67 (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78 (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16 (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48 (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2 (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33 (3), 580-598 (1983).

Tags

Keywords: 16S RRNA Gene SequencingMALDI-TOF MSRare Bacterial PathogensMyroidesOdoratimimusBacterial DNA Extraction16S RRNA PCRSanger SequencingMALDI-TOF MS AnalysisMALDI Biotyper SoftwareBacterial IdentificationDiagnostic Microbiology
check_url/it/53176?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image