Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

Summary

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Abstract

Es gibt eine Reihe von seltenen und daher unzureichend bakterielle Pathogene beschrieben, die schwere Infektionen berichtet werden insbesondere bei immunsupprimierten Patienten zu verursachen. In den meisten Fällen nur wenige Daten, meist als Fallberichte veröffentlicht, zur Verfügung, die die Rolle solcher Krankheitserreger wie ein infektiöses Agens untersuchen. Daher wird, um die pathogene Charakter solcher Mikroorganismen zu klären, ist es notwendig, epidemiologische Studien durchzuführen, die eine große Anzahl dieser Bakterien umfassen. Die verwendeten Methoden in einer solchen Überwachung Studie haben die folgenden Kriterien erfüllen: die Identifizierung der Stämme hat genau zu sein nach der gültigen Nomenklatur, sollten sie leicht sein (Robustheit), sparsam in der Routinediagnostik zu handhaben, und sie haben zu erzeugen, vergleichbar Ergebnisse unter verschiedenen Labors. Im Allgemeinen gibt es drei Strategien für die Bakterienstämme in einer Routineeinstellung identifiziert: 1) phänotypische Identifizierung der BioChemica charakterisierendenl und metabolischen Eigenschaften der Bakterien, 2) Molekulartechniken wie 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und 3) Massenspektrometrie als neuartige Proteom basierten Ansatz. Da Massenspektrometrie und molekularen Ansätzen die vielversprechendsten Mittel zur Identifizierung einer Vielzahl von Bakterienarten sind, sind diese beiden Methoden beschrieben. Die Fortschritte, Grenzen und mögliche Probleme bei der Anwendung dieser Techniken werden diskutiert.

Introduction

Sichere Identifizierung von seltenen Krankheitserregern in der Routinediagnostik wird durch die Tatsache erschwert, dass die klassische kulturelle und biochemische Methoden sind umständlich und manchmal fragwürdig. Darüber hinaus hat ein diagnostisches mikrobiologischen Labor eine große Anzahl von Krankheitserregern zu verarbeiten, von ein paar hundert bis zu mehreren tausend hin, täglich, die die Verwendung von automatisierten Systemen erfordert. Zusätzlich zu der Verwaltung eines hohen Tagesdurchsatz, die genaue Identifizierung von Bakterienspezies erforderlich. Dies ist gerechtfertigt , da sie in ihrer antimikrobiellen Empfindlichkeitsmuster unterscheiden und damit die korrekte Identifizierung liefert dem Arzt wichtige Informationen geeigneten Antibiotika zu wählen (zB Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) ^12,43.

Automatisierte mikrobiellen Identifizierungssysteme (AMIS) gelten standardisierte Sätze von enzymatischen Reaktionen, die metabolischen Eigenschaften von bakteriellen Isolate zu charakterisieren <sup> 13,15,16,26,27. Obwohl die in diesen Systemen verwendeten Patronen verwenden , um eine große Anzahl von verschiedenen biochemischen Reaktionen, zum Beispiel 47 in der GN – Karte der AMIS in dieser Studie verwendeten ^52, diese Strategie erlaubt eine sichere Identifikation nur für eine begrenzte Anzahl von Bakterien. Weiterhin wird die Datenbank, ein fortschrittliches Expertensystem fokussiert klar auf der Erfassung der relevanten und hoch relevanten Bakterien von medizinischer Bedeutung ^13,15,16,36. Zwei weitere Systeme, die weithin in Laboratorien verwendet werden, gelten auch für diese biochemische Ansatz zur Identifizierung von Bakterien. Jüngste Studien zeigen eine vergleichbare Identifikationsgenauigkeit zwischen den Amis in dieser Studie und einer der Wettbewerber verwendet (93,7% bzw. 93,0%), während die ^3. AMIS eine Identifikationsgenauigkeit von nur 82,4% hat auf Art ³⁵ nivellieren. Solche Abweichungen können von der Qualität der zugrunde liegenden Identifikationsdatenreferenzen, die Versionen von Kits und Software, Unterschiede in metabo erklärt werdenlism und Kenntnisse des technischen Personals ^35,36.

Zwei automatisierte MALDI-TOF-MS-Systeme (MALDI-TOF mikrobiellen Identifizierungssystem, MMIS) werden hauptsächlich verwendet. Diese Systeme ermöglichen die Erfassung einer großen Anzahl von Bakterienspezies auf der Grundlage ihrer Protein Fingerabdruck-Massenspektren. Zum Beispiel verwendet die Datenbank des MMIs enthält 6,000 Referenzspektren. Identifikationssysteme basierend auf Massenspektrometrie bieten schnelle und zuverlässige Detektion einer Vielzahl von Mikroorganismen , einschließlich seltene Erreger ^11,48,51. Bis heute sind nur wenige direkte Vergleiche zwischen den verfügbaren MMIS in dieser Studie und der Wettbewerber verwendet ^19,33. Gemäß Daek et al. Beide Systeme bieten eine ähnlich hohe Rate der Identifikationsgenauigkeit, aber die in dieser Studie verwendet MMIs scheint in Speziesidentifizierung ¹⁹ zuverlässiger zu sein.

In ähnlicher Weise Adressieren molekulare Techniken gut konserviert, sondern auch verschiedene Gene ( <em> zB 16S rDNA oder rpoB) ermöglichen eine eindeutige Identifizierung von Arten ^3,22,61. Unter diesen ist die 16S – rDNA der am häufigsten verwendete Housekeeping – Gen wegen seiner Präsenz in allen ³⁴ Bakterien. Seine Funktion unverändert bleibt und schließlich mit etwa 1500 bp, das lang genug ist , für Bio-Informatik ^14,34 eignen. Viele Forscher betrachten 16S rRNA – Gen – Analyse als "Gold-Standard" für die Identifizierung von Bakterien ^21. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass nur wenige Laboratorien DNA-DNA – Hybridisierungstechniken bisher zur Identifizierung von seltenen oder neue Bakterien ^14,34 verwenden. Darüber hinaus werden immer mehr Datenbanken verfügbar , die für die 16S – rRNA – Gen – Analyse ⁵⁰ verwendet werden kann. Sie hat jedoch berücksichtigt werden, dass 16S rDNA basierten Detektionssystemen haben eine begrenzte Empfindlichkeit gegenüber Standard-PCR-Protokolle. Darüber hinaus ist die molekulare Ansatz anspruchsvoll, zeitaufwendig und erfordert gut ausgebildetes Personal sowiegewidmet Laboreinrichtungen und ist daher nicht so leicht in die Routinediagnostik implementiert ^55. Darüber hinaus hat es sich gezeigt, dass die Kombination von mindestens zwei verschiedenen Methoden der Bakterienidentifikation zur hochgenauen Dehnungs Identifizierung führt. Die Kombination von MALDI-TOF MS und 16S-rDNA-Sequenzierung erlaubt die Identifizierung einer großen Anzahl von verschiedenen Bakterienspezies mit hoher Genauigkeit. Vor kurzem hat die Kombination von MALDI-TOF – MS und 16S rRNA – Gen – Analyse wurde ⁵⁶ zur Identifizierung von Bakterien studieren epidemiologische Fragestellungen und seltene Krankheitserreger vorgestellt.

Protocol

1. Extraktion von Bakterien-DNA Herstellung der PBS-Lösung Wiegen 1,65 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g NaH 2 PO 4 x 2H 2 O und 8,80 g NaCl in einem Kolben und füllt mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml. Den pH-Wert auf 7,4. Für die endgültige Verwendung filtern Sie die Lösung durch eine bakteriendichte (0,22 & mgr; m-Filter). DNA Extraction of Gram-negative Bacteria Streak das Pati…

Representative Results

MALDI-TOF-MS ist eine neue, schnelle und kostengünstige Methode für die mikrobiologische Routinediagnostik. Bakterielle Artbestimmung durch MALDI-TOF – MS – Spektren produziert hauptsächlich aus ribosomalen Proteinen zusammengesetzt , sondern auch andere "sehr konservierten Proteinen mit Housekeeping Funktionen beeinträchtigt in geringem Umfang durch die Umgebungsbedingungen" 17 .Die Datenbank dieser MMIS enthält eine große Menge von Referenzspektren und sogar …

Discussion

Sowohl MALDI-TOF MS und 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung bieten die Möglichkeit, eine große Anzahl von verschiedenen Bakterien zu identifizieren. MALDI-TOF-MS ist eine schnelle und kostengünstige Methode, die leicht zu handhaben und große Datenbanken von bakteriellen Massenspektren zur Verfügung. Aus diesem Grund ist MALDI-TOF MS eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methode zum Screening Studien konzentrierten sich auf seltene bakterielle Pathogene ^17,20,39,51 zuführen. In einer prospektiven Studi…

Materials

CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	270733
Tissue Lyser LT	Qiagen, Hilden, Germany	85600	Oscillating Homogenizer
Glass-beads 1,0mm	VWR International, Darmstadt, Germany	412-2917
Thermomixer 5436	Eppendorf, Hamburg, Germany	2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250)	Qiagen, Hilden, Germany	51306
Taq PCR Core Kit (1000 U)	Qiagen, Hilden, Germany	201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)	biomers.net GmbH, Ulm, Germany	–
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´)	biomers.net GmbH, Ulm, Germany	–
Mastercycler	Eppendorf, Hamburg, Germany	-	Thermocylcer
Reaction tube 1.5 mL	SARSTEDT, Nümbrecht, Germany	72,692
Reaction tube 2 mL	SARSTEDT, Nümbrecht, Germany	72,693,005
PCR 8er-CapStrips	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	711040X
PCR 8er-SoftStrips	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	711030X
Sharp R-ZV11	Sharp Electronics, Hamburg, Germany	–	Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg)	Merck, Darmstadt, Germany	1084211000
SeaKem LE Agarose	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	849006
(2 x 500 g)
SmartLadder SF – 100 to 1000 bp	Eurogentec, Lüttich, Belgium	MW-1800-04
Bromphenol blue (25 g)	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	B0126
Xylene cyanol FF (10 g)	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	X4126
ComPhor L Maxi	Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany	–
Ethidium bromide solution 1 %(10 mL)	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2218.1
Gel Doc 2000	Bio-Rad Laboratories, München, Germany	–	Gel-documentation system
ExoSAP-IT (500 reactions)	Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom	78201
Buffer (10 x) with EDTA	Life Technologies, Darmstadt, Germany	402824
BigDye Terminator Kit v1.1	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4337450
Hi-Di formamide (25 mL)	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)	Qiagen, Hilden, Germany	63206
3130 Genetic Analyzer	Life Technologies, Darmstadt, Germany	–	Sequenzer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mL	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4333466
Sequencing Analysis Software 5.4	Life Technologies, Darmstadt, Germany	–
microflex (the MALDI TOF MS maschine)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	–
MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	–	our mMIS
VITEK MS	bioMérieux, Nürtingen, Germany		2nd mMis
flexControl 3.4 (control software)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	–
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	–
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	201344
Peptide Calibration Standard II	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	222570
MSP 96 target polished steel	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8224989
peqgreen	peqlab	37-5010
MALDI Biotyper Galaxy	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	Part No. 1836007
Vitek 2	bioMérieux, Nürtingen, Germany		our aMis
MicroScan	Beckman Coulter		2nd aMis
BD Phoenix™ Automated Microbiology System	BD		3rd aMis
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™)	ATCC		postive control for PCR