We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.
Detektere små koncentrationer af molekyler ned til enkelt molekyle grænse har indflydelse på områder som tidlig påvisning af sygdommen, og de grundlæggende undersøgelser af opførslen af molekyler. Enkelt molekyle påvisningsteknikker almindeligvis udnytte mærker såsom fluorescerende tags eller kvantepunkter, men etiketterne er ikke altid tilgængelige, øger omkostningerne og kompleksiteten, og kan forstyrre de begivenheder, der undersøges. Optiske resonatorer er dukket op som et lovende middel til at påvise enkelte molekyler uden brug af etiketter. Øjeblikket er den mindste partikel detekteres af en ikke-plasmonically forbedret nøgne optiske resonator systemet i opløsning er en 25 nm polystyren kugle 1. Vi har udviklet en teknik kendt som Frequency Låsning Optical Whispering Evanescent Resonator (BLOMST), der kan overgå denne grænse og opnå etiket-fri enkelt molekyle detektion i vandig opløsning 2. Som signalstyrken skalaer med partikel volumen, vores arbejde repræsenterer en> 100x improvement i signal-støjforholdet (SNR) i løbet af den aktuelle stade til. Her procedurerne bag FLOWER præsenteres i et forsøg på at øge dens anvendelse i marken.
Enkelt molekyle afsløring eksperimenter er nyttige til at reducere mængden af analyt anvendes i biosensorer, til tidlig opdagelse af sygdomme, og for at undersøge de grundlæggende egenskaber af molekyler 3. Sådanne eksperimenter udføres typisk ved anvendelse af etiketter, dog etiketter er ikke altid muligt at opnå for et bestemt protein, øger omkostningerne, kan forstyrre de begivenheder, der undersøges, og kan være ubelejligt, især til tidstro på stedet forsøg eller point-of- pleje diagnostik.
Den nuværende gyldne standard for etiketfrie biosensorer er overfladeplasmonresonans 4, men de kommercielle overfladeplasmonresonans systemer har typisk en typisk nedre detektionsgrænse på rækkefølgen af nM. For nylig har optiske resonatorer dukket op som en lovende teknologi til etiket-fri enkelt molekyle Biodetection 5. Optisk resonatorer arbejde baseret på de langsigtede (NS) indespærring af lys 6,7. Lys er udklingendekoblet ind i disse anordninger typisk via en optisk fiber. Når bølgelængden af det lys, der går gennem fiberen matcher resonans bølgelængden for resonator, lyser effektivt kobles til resonatoren. Dette kombineret lys helt internt reflekterer i resonator hulrum frembringe et kortvarigt felt i nærheden af omkredsen af resonatoren. Som partikler ind i flygtige felt og binder til resonator, resonans bølgelængden resonatorens ændringer i forhold til mængden af partiklen 8.
Med hensyn til påvisning kapacitet, har mikrosfæreformuleringer resonatorer tidligere blevet anvendt til at påvise enkelt influenza A-virus partikler (100 nm) 9,10. For nylig har plasmonically forbedret mikrokugle optiske resonatorer blevet anvendt til at påvise enkelt okseserumalbumin molekyler 11 og 8-mer oligonucleotider 12, men denne fremgangsmåde begrænser partiklen fangstområdet til 0,3 um 2 pr device. Større fangstområdet biosensorer er ideelle til at maksimere chancen for afsløring partikel. Nuværende løsning-baserede label-fri biosensorer teknologier med store (> 100 um 2) capture områder er blevet begrænset til detektering polystyrenpartikler ≥ 25 nm.
Vi har udviklet en etiket-fri biosensorer baseret på optiske resonator teknologi kaldet Frequency Låsning Optical Whispering Evanescent Resonator (BLOMST) 13 (figur 1), der er i stand til tidsopløst påvisning af enkelte molekyler i opløsning. FLOWER bruger lang foton levetid microtoroid optiske resonatorer kombineret med frekvens låsning feedback-kontrol, afbalanceret afsløring og beregningsmæssige filtrering til at opdage små partikler ned til enkelte proteinmolekyler. Anvendelsen af frekvens låsning tillader systemet at spore altid skiftende resonans af microtoroid som partikler binder, uden behov for at feje eller scanne laserbølgelængden istore intervaller. Principperne for FLOWER kan anvendes til at forbedre sporingskapaciteten af andre teknikker, herunder plasmoniske ekstraudstyr. I det følgende er procedurerne for udførelse af FLOWER beskrevet.
Som en partikel binder, resonans bølgelængden (λ) toroidens stiger. Hvis en partikel unbinds, resonans bølgelængde tilsvarende aftager (en step-down begivenhed). Partikeldiameteren (d) kan bestemmes ved histogrammer af amplituden af hver bølgelængde trin. Højden af hver bølgelængde trin varierer på grund af størrelse variationer af den bundne partikel og på grund af placeringen på microtoroid hvor partiklen bindes. Den maksimale ændring i resonans bølgelængde (trinhøjde) opstår…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported in part by a National Research Service Award (T32GM07616) from the National Institute of General Medical Sciences.
Tunable diode laser | Newport | TLB-6300 |
Laser controller | Newport | TLB-6300-LN |
Frequency locking feedback controller | Toptica Photonics | Digilock 110 |
Auto-balanced photoreceiver | Newport | Model 2007 |
In-line polarization controller | General Photonics | PLC-003-S-90 |
24-bit data acquisition card | National Instruments | NI-PCI-4461 |
Recombinant human interleukin-2 | Pierce Biotechnology | R201520 |
20 nm polystyrene beads | Thermo Scientific | 3020A |
NanoCube XYZ Piezo Stage | Physik Instrumente | P-611.3 |
Optical table | Newport | VH3660W-OPT |
Objective lens for imaging column | Navitar Machine Vision | 1-60228 |
Imaging column (adaptor tube) | Navitar Machine Vision | 1-60228 |
High-Res CCD camera for imaging column | Edmund Industrial Optics | NT39244 |