Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Summary

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Abstract

Nachweis kleiner Konzentrationen von Molekülen bis zur Einzelmolekül Grenze hat Auswirkungen auf Bereiche wie die Früherkennung von Krankheiten und grundlegenden Studien über das Verhalten von Molekülen. Einzelmoleküldetektionsverfahren verwenden üblicherweise Markierungen, wie Fluoreszenzmarkierungen oder Quantenpunkte sind jedoch nicht immer verfügbar Etiketten, erhöhen die Kosten und die Komplexität und kann stören die Ereignisse untersucht. Optischen Resonatoren als ein vielversprechendes Mittel zur Einzelmoleküle ohne Einsatz von Etiketten erfassen taucht. Derzeit kleinste durch eine nicht plasmonically verstärkte blanke optische Resonatorsystem in Lösung nachgewiesen Teilchen ein 25 nm Polystyrolkugel ^1. Wir haben eine Technik, die als Frequenzverriegelung Optical Whispering Evanescent Resonator (Blume), die in wässriger Lösung ² dieses Limit übertreffen können und erreichen markierungsfreie Einzelmoleküldetektion bekannt entwickelt. Als Signalstärke Waage mit Partikelvolumen, unsere Arbeit für eine> 100x improvement im Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) über den aktuellen Stand der Technik. Hier die Verfahren hinter FLOWER werden in dem Bemühen, ihre Nutzung auf dem Gebiet erhöhen vorgestellt.

Introduction

Einzelmoleküldetektion Experimente sind nützlich für die Verringerung der Menge an Analyt in Biosensoren verwendet wird, für die Früherkennung von Krankheiten und zur Untersuchung der grundlegenden Eigenschaften von Molekülen ^3. Solche Experimente werden normalerweise mit den Etiketten sind jedoch Etiketten nicht immer möglich, für ein bestimmtes Protein zu erhalten, erhöhen die Kosten, können stören die Ereignisse untersucht und kann unbequem sein, insbesondere für die Echtzeit-Vor-Ort-Versuche oder Point-of- Care-Diagnostik.

Der aktuelle Goldstandard für die markierungsfreien Biosensor ist die Oberflächenplasmonresonanz ^4, aber die kommerziellen Oberflächenplasmonresonanz-Systeme haben in der Regel eine typische untere Nachweisgrenze in der Größenordnung von nM. In jüngster Zeit haben optische Resonatoren als vielversprechende Technologie für markierungsfreie Einzelmolekül Biodetektion ⁵ entstanden. Optischen Resonatoren Arbeit auf der Grundlage der langfristigen (ns) Führung von Licht ^6,7. Licht ist evaneszenttypischerweise über eine optische Faser in diese Geräte gekoppelt sind. Wenn die Wellenlänge des Lichts geht durch die Faser entspricht der Resonanzwellenlänge des Resonators, Licht wirksam koppelt an den Resonator. Dieses gekoppelte Licht vollständig intern reflektiert innerhalb des Resonators Hohlraum Erzeugung eines evaneszenten Feldes in der Nähe des Umfangs des Resonators. Als Partikel in das evaneszente Feld und binden an den Resonator, der Resonanzwellenlänge des Resonators ändert sich proportional zu dem Volumen des Teilchens ^8.

In Bezug auf die Erfassungsfähigkeit, haben Mikrokugelresonatoren früher verwendet worden, um einzelne Influenza-A-Virus-Partikel zu erkennen (100 nm) ^9,10. Kurzem plasmonically verstärkte Mikrokugel optischen Resonatoren sind verwendet worden, um einzelne Rinderserumalbuminmoleküle detektieren ^{11 und 8-mer} Oligonukleotiden ^12, aber dieser Ansatz begrenzt die Partikelfangbereich auf 0,3 & mgr; m ² pro deLaster. Größere Capture-Bereich Biosensoren sind ideal für die Maximierung der Wahrscheinlichkeit des Partikeldetektion. Aktuelle lösungsbasierten markierungsfreien Biosensor-Technologien mit großen (> 100 & mgr; m ²⁾ Capture-Bereiche wurden auf die Erfassung Polystyrol-Partikel ≥ 25 nm beschränkt.

Wir haben einen markierungsfreien Biosensor-System auf Basis von optischen Resonator-Technologie als Frequenzverriegelung Optical Whispering Evanescent Resonator (BLUME) ¹³ (Abbildung 1) bekannt, die in der Lage, zeitaufgelöste Detektion von Einzelmolekülen in Lösung entwickelt. FLOWER verwendet die lange Lebensdauer der Photonen Mikrotoroid optischen Resonatoren in Kombination mit Frequenzsperr Regelung, ausgeglichen Erkennung und Rechen Filterung, um kleine Partikel bis hin zu einzelnen Proteinmoleküle zu erkennen. Die Verwendung von Frequenzverriegelung kann das System immer verfolgen die Verschiebung Resonanz des Mikrotoroid als Teilchen zu binden, ohne die Notwendigkeit zu kehren oder Scannen der Laserwellenlänge übergroße Bereiche. Die Grundsätze der FLOWER verwendet werden, um die Erkennungsfähigkeiten von anderen Techniken, einschließlich plasmonischer Steigerung zu erhöhen. Im Folgenden werden die Verfahren für die Durchführung FLOWER beschrieben.

Protocol

1. Versuchsaufbau und die Probenvorbereitung Herzustellen Mikrotoroide Verwendung der Lithographie, Ätzen und Schmelzvorgang, wie zuvor. 6 beschrieben Herzustellen Mikrotoroide auf einem Silizium-Wafer (Chip), die typischerweise einen Außendurchmesser von 80-100 um und einem kleineren Durchmesser von 2 um. Entspannen etwa einen Meter von single-mode optische Faser (125 um Verkleidungen, 4,3 um Modenfelddurchmesser) von ihrer Faserspule. In der Mitte des abgewickelten Abschnitt…

Representative Results

Partikelbindungsereignisse eindeutig als stufenartigen Änderungen in der Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid über die Zeit (2A) ersichtlich. Die Höhen dieser Schritte sind als Histogramm in Figur 2B gezeigt. Die Abbildungen 2-4 zeigen repräsentative Spuren aus der Bindung von Exosomen (nanovesicles), 5 nm Silikonkügelchen, einzelne menschliche Interleukin-2-Moleküle sind. Die Tatsache, dass die stufenartigen Ereignissen Skala mit Teilchengröße zeigt, daß das V…

Discussion

Als ein Teilchen gebunden ist, die Resonanzwellenlänge (λ) der Toroid zunimmt. Wenn ein Teilchen tatsächlich freigegeben wird, die Resonanzwellenlänge nimmt entsprechend ab (ein Untersetzungsereignis). Der Partikeldurchmesser (d) kann durch Histogramme der Amplitude jeder Wellenlänge Schritt bestimmt werden. Die Höhe jeder Wellenlänge Schritt variiert je nach Größenvariationen des gebundenen Teilchen und durch die Lage auf der Mikrotoroid wo das Teilchen bindet. Die maximale Änderung der Reso…

Materials

Tunable diode laser	Newport	TLB-6300
Laser controller	Newport	TLB-6300-LN
Frequency locking feedback controller	Toptica Photonics	Digilock 110
Auto-balanced photoreceiver	Newport	Model 2007
In-line polarization controller	General Photonics	PLC-003-S-90
24-bit data acquisition card	National Instruments	NI-PCI-4461
Recombinant human interleukin-2	Pierce Biotechnology	R201520
20 nm polystyrene beads	Thermo Scientific	3020A
NanoCube XYZ Piezo Stage	Physik Instrumente	P-611.3
Optical table	Newport	VH3660W-OPT
Objective lens for imaging column	Navitar Machine Vision	1-60228
Imaging column (adaptor tube)	Navitar Machine Vision	1-60228
High-Res CCD camera for imaging column	Edmund Industrial Optics	NT39244