Singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando Microtoroid ottici Risonatori

Summary

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Abstract

Rilevamento piccole concentrazioni di molecole fino al limite singola molecola ha un impatto su settori quali la diagnosi precoce della malattia, e studi fondamentali sul comportamento delle molecole. Tecniche di rilevazione di singola molecola comunemente utilizzano etichette come etichette fluorescenti o punti quantici, tuttavia, le etichette non sono sempre disponibili, aumentare i costi e la complessità, e possono perturbare gli eventi in fase di studio. Risonatori ottici sono emersi come un mezzo promettente per rilevare singole molecole senza l'uso di etichette. Attualmente la più piccola particella rilevata da un sistema di risuonatore non plasmonically potenziato nudo ottica in soluzione è a 25 nm di polistirolo sfera ^1. Abbiamo sviluppato una tecnica nota come frequenza di blocco ottico Whispering Evanescent risonatore (fiore) in grado di superare questo limite e ottenere la diagnosi singola molecola label-free in soluzione acquosa ^2. La potenza del segnale scale con il volume delle particelle, il nostro lavoro rappresenta un> 100x improvement nel rapporto segnale-rumore (SNR) rispetto allo stato attuale della tecnica. Qui le procedure dietro fiore sono presentati in uno sforzo per aumentare il suo utilizzo nel settore.

Introduction

Esperimenti rilevamento molecole singole sono utili per ridurre la quantità di analita usato in biosensori, per la diagnosi precoce della malattia, e per esaminare le proprietà fondamentali delle molecole ^3. Tali esperimenti sono tipicamente eseguite utilizzando etichette, tuttavia, le etichette non sono sempre possibile ottenere per una particolare proteina, aumenta il costo, può perturbare gli eventi oggetto di studio, e può essere scomodo, particolarmente per tempo reale in loco esperimenti o point-of- Diagnostica di cura.

Il gold standard attuale per biosensing label-free è risonanza plasmonica di superficie ^4, ma i sistemi commerciali di risonanza plasmonica di superficie in genere hanno un tipico limite inferiore di rilevamento dell'ordine di nM. Recentemente, risonatori ottici sono emersi come una tecnologia promettente per libero etichetta singola molecola biorilevazione ^5. Risonatori ottica lavoro basato sul lungo termine (ns) confinamento della luce ^6,7. La luce è evanescentlyaccoppiato in questi dispositivi tipicamente attraverso una fibra ottica. Quando la lunghezza d'onda della luce che attraversa la fibra corrisponde alla lunghezza d'onda di risonanza del risonatore, illuminare efficientemente accoppia il risonatore. Questa luce accoppiata riflette totalmente internamente la cavità del risonatore a generare un campo evanescente in prossimità della circonferenza del risonatore. Come particelle entrano campo evanescente e si legano al risuonatore, la lunghezza d'onda di risonanza dei cambiamenti risonatore in proporzione al volume della particella ^8.

In termini di capacità di rilevamento, risonatori di microsfere sono stati in precedenza utilizzata per rilevare l'influenza A solo particelle virali (100 nm) ^9,10. Recentemente, plasmonically avanzata microsfere risonatori ottici sono stati utilizzati per rilevare siero albumina bovina singola molecole ^{11 e} oligonucleotidi 8-mer ^12, tuttavia questo approccio limita l'area di cattura delle particelle di 0,3 micron ^{2 per} device. Più grandi biosensori zona di cattura sono ideali per massimizzare la probabilità di rilevamento delle particelle. Le attuali tecnologie basate su soluzioni label-free biosensori con grandi (> 100 micron ²⁾ aree di acquisizione si sono limitati a rilevare particelle di polistirene ≥ 25 nm.

Abbiamo sviluppato un sistema di biosensori label-free basato sulla tecnologia risonatore ottico noto come frequenza di blocco ottico Whispering Evanescent risonatore (FIORE) ¹³ (Figura 1), che è in grado di rilevare in tempo risolto di singole molecole in soluzione. FIORE utilizza la lunga durata fotone di risonatori ottici microtoroid combinati con frequenza di blocco di controllo di retroazione, il rilevamento equilibrato, e il filtraggio di calcolo per rilevare piccole particelle fino a singole molecole proteiche. L'uso di aggancio in frequenza consente al sistema di monitorare sempre la risonanza spostamento del microtoroid come particelle si legano, senza la necessità di spazzare o la scansione della lunghezza d'onda del laser sopragrandi intervalli. I principi di FLOWER possono essere utilizzati per migliorare le capacità di rilevazione delle altre tecniche, tra cui la valorizzazione plasmonica. In ciò che segue, vengono descritte le procedure per l'esecuzione FIORE.

Protocol

1. Setup sperimentale e preparazione del campione Realizzare microtoroids utilizzando la litografia, incisione, e di fusione procedura descritta in precedenza 6. Realizzare microtoroids sulla cima di un wafer di silicio (chip) che tipicamente hanno un diametro maggiore di 80-100 micron, e un diametro minore di 2 micron. Rilassatevi circa un metro di fibra ottica monomodale (125 rivestimento micron, 4,3 micron modo diametri campo) dalla bobina di fibra. Al centro della parte srot…

Representative Results

Eventi di legame delle particelle sono chiaramente visto come variazioni a gradino in lunghezza d'onda di risonanza del microtoroid nel tempo (Figura 2A). Le altezze di questi passaggi sono indicati come un istogramma della figura 2B. Figure 2-4 mostrano tracce rappresentative del legame di esosomi (nanovesicles), 5 nm perline di silice, e single umane interleuchina-2 molecole, rispettivamente. Il fatto che gli eventi a gradino scala con granulometr…

Discussion

Come si lega una particella, la lunghezza d'onda di risonanza (λ) del toroide aumenta. Se una particella non associa, la lunghezza d'onda di risonanza diminuisce corrispondentemente (un evento step-down). Il diametro delle particelle (d) può essere determinata attraverso istogrammi di ampiezza di ogni passo di lunghezza d'onda. L'altezza di ogni gradino d'onda varia a causa di variazioni dimensionali della particella legato e causa la posizione sulla microtoroid cui si lega la par…

Materials

Tunable diode laser	Newport	TLB-6300
Laser controller	Newport	TLB-6300-LN
Frequency locking feedback controller	Toptica Photonics	Digilock 110
Auto-balanced photoreceiver	Newport	Model 2007
In-line polarization controller	General Photonics	PLC-003-S-90
24-bit data acquisition card	National Instruments	NI-PCI-4461
Recombinant human interleukin-2	Pierce Biotechnology	R201520
20 nm polystyrene beads	Thermo Scientific	3020A
NanoCube XYZ Piezo Stage	Physik Instrumente	P-611.3
Optical table	Newport	VH3660W-OPT
Objective lens for imaging column	Navitar Machine Vision	1-60228
Imaging column (adaptor tube)	Navitar Machine Vision	1-60228
High-Res CCD camera for imaging column	Edmund Industrial Optics	NT39244