Generering af prostatakræft Patient Afledt xenograftmodeller fra Cirkulerende tumorceller

Summary

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Abstract

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

Introduction

Patient afledte xenotransplantater bliver stadig mere populære eksperimentelle modeller, der anvendes til kræftforskning. De kan bruges til karakterisering af biomarkører og biologiske veje, præklinisk evaluering af narkotika effekt, og skabelse af avatarer for personlige behandlinger mod kræft ^1,2. Tidligere har andre forskergrupper udviklet PDX-modeller enten ved at implantere eller indsprøjte en enkelt tumor celle suspensioner eller hel tumoreksplantater i immunkompromitterede mus ^1. Disse PDX modeller kræver kirurgisk samling af fersk fast tumor, maligne ascites eller pleuraeffusion fra en patient, der gennemgår et kirurgisk indgreb, som er både dyrt og udsætter patienten for forøget risiko for iatrogen sygelighed.

En væsentlig seneste udvikling i cancerforskning har været påvisning, isolering og karakterisering af cirkulerende tumorceller. Disse tumorceller undslippe fra den primære tumormasse og komme i omløbhvor de spiller en afgørende rolle i metastase og tilbagefald, den mest almindelige årsag til kræft dødelighed ^3. Evalueringen og karakterisering af CTCs fra flere solide tumortyper har givet klinisk information til diagnose, prognose, og overvågning af residual sygdom ^3. En række tiden anvendte fremgangsmåder er afhængige af enten de fysiske egenskaber, ekspression af biomarkører, eller funktionelle kendetegn CTCs kan anvendes til effektivt at isolere CTCs ^4. Eksisterende makroskala CTC isoleringsmetoder omfatter densitetsgradientcentrifugering, fysisk filtrering med filterporer og separation mod overflademolekyler. Den mest udbredte CTC isolation metoder er baseret på antistof-baserede indfangning af CTCs. Både positive og negative udvælgelse af celleoverflademarkører kan anvendes til at isolere CTCs fra perifert blod. Positiv selektion for CTCs i den perifere cirkulation anvender almindeligvis epiteliale markører (f.eks EpCAM), som enre udtrykt på CTCs men ikke hæmatopoietiske celler. Ulempen ved denne fremgangsmåde er, at CTCs med metastatisk potentiale ofte har undergået epitel-til-mesenchymal overgang (EMT), som nedregulerer epiteloverflade ³ markører. For at isolere CTCs med metastatisk potentiale, at en negativ selektion metode, som anvender det hæmatopoietiske overflade markering, CD45, nedbryder den normale cellepopulation af leukocytter kan anvendes ^5.

Prostatacancer er den hyppigst diagnosticerede cancer og en væsentlig årsag til cancer-relaterede dødsfald blandt mænd ^6. Mekanismerne på tumorudvikling og aggressivitet er ikke fuldstændig forstået, og derfor generering og karakterisering af eksperimentelle modeller, der rekapitulere molekylære heterogenitet af prostatacancer er af væsentlig interesse. PDX modeller af prostatacancer har været tidligere genereret ved transplantation af humane prostata kræftceller ind immunocomlovede mus ^7,8. Men frembringelsen af ​​sådanne modeller har været hæmmet af den lave pris indpodning af prostatacancer i immunkompromitterede mus, der primært tilskrives den indolente sygdommens art. For nylig har CTCs blevet anvendt til at generere brystcancer ^9, lungecancer ^{10 og} prostatacancer ¹¹ PDX modeller. Disse proof-of-concept studier indført mulighed for at generere PDX modeller uafhængigt af behovet for kirurgisk prøveindsamling. I denne artikel beskriver vi i detaljer en fremgangsmåde til frembringelse af denne hidtil ukendte forsøgsmodel.

Protocol

Denne protokol er blevet udført på vores institution med godkendelse fra den institutionelle forskningsetik bestyrelse og er i overensstemmelse med alle institutionelle, nationale og internationale retningslinjer for menneskelig velfærd. 1. Indsamling af perifert blod fra patienter med fremskreden prostatakræft Bemærk: Vælg patienter med metastatisk prostatacancer. Indhente skriftlig patient samtykke og optage kliniske karakteristika for patienter, herunder a…

Representative Results

Denne protokol vil føre til dannelse af PDX-modeller fra isolerede CD45 negativ prostatakræft CTCs. Baseret på den negative udvælgelsesmetode anvendes i vores protokol er det nødvendigt at udelukke døde celler ved hjælp af DAPI-farvet. Procentdelen af CD45-negative celler påvist ved flowcytometri er variabel og afhænger af tumorbyrde af patienten (figur 1A). Immunfluorescensfarvning af usorterede celler under anvendelse af CD45 og DAPI (til identifikation cellekerner) afslører CD45-negative ce…

Discussion

Dette manuskript beskriver en metode til generering af prostatacancer PDX modeller CTCs. Anvendelsen af ​​CTCs til generering af PDX modeller har flere potentielle vigtige fordele sammenlignet med eksisterende fremgangsmåder. Først tilgængelige samling af CTCs fra perifert blod giver genereringen af ​​eksperimentelle modeller fra den samme patient ved forskellige sygdomsstadier. For det andet, repræsenterer blodtapning en mere sikker og billig metode til at isolere tumorceller sammenlignet…

Materials

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2×2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 gauge needle
1 ml syringe