Generation von Prostatakrebs-Patienten gewonnen Xenograft-Modelle von zirkulierenden Tumorzellen

Summary

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Abstract

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

Introduction

Patienten abgeleitet Xenotransplantate werden immer beliebter experimentelle Modelle für die Krebsforschung eingesetzt. Sie können für die Charakterisierung von Biomarkern und biologische Pfade, präklinische Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten, und die Schaffung von Avataren für personalisierte Krebstherapien ^1,2 verwendet werden. Zuvor haben andere Forschungsgruppen PDX-Modelle entweder durch Implantation oder Injektion von einzelnen Tumorzellsuspensionen oder ganze Tumor Explantate in immungeschwächten Mäusen ¹ entwickelt. Diese PDX Modelle erfordern chirurgische Sammlung von frischen soliden Tumor, malignen Aszites oder Pleuraerguss von einem Patienten, der sich einem chirurgischen Eingriff, die sowohl teuer ist und setzt den Patienten einem erhöhten Risiko der iatrogenen Morbidität.

Eine signifikante neue Entwicklung in der Krebsforschung ist die Detektion, Lokalisierung und Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen. Diese Tumorzellen zu entkommen aus dem primären Tumormasse und geben Zirkulationwo sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Metastasierung und Rückfall, ist die häufigste Ursache von Krebs bedingte Sterblichkeit ^3. Die Auswertung und Charakterisierung von CTCs aus verschiedenen soliden Tumorarten haben klinische Informationen für die Diagnose, Prognose und Überwachung von Resterkrankung ³ zur Verfügung gestellt. Eine Vielzahl von derzeit verwendeten Ansätze sich auf entweder die physikalischen Eigenschaften, die Expression von Biomarkern oder Gebrauchseigenschaften CTCs kann verwendet werden, um effizient zu isolieren CTCs ⁴ werden. Bestehende Makro CTC Isolationsverfahren beinhalten Dichtegradientenzentrifugation, körperliche Filtration mit Filterporen und Trennung gegen Oberflächenmoleküle. Die am weitesten verbreitete CTC Isolierung Methoden werden auf Antikörper-basierte Erfassung von CTC basiert. Sowohl positive als auch negative Selektion von Zelloberflächenmarkern verwendet werden, um CTCs aus peripherem Blut zu isolieren. Positive Selektion für CTCs im peripheren Kreislauf verwendet allgemein epithelialen Marker (zB EpCAM), die einewieder auf CTCs aber nicht hämatopoetischen Zellen exprimiert. Der Nachteil dieser Methode ist, dass CTCs mit metastatischem Potenzial oft epithelial-to-mesenchymale Transition (EMT), die Epitheloberfläche Marker ³ downregulates zogen. Um CTCs mit metastatischen Potential zu isolieren, eine negative Selektionsmethode, die den blutbildenden Oberflächenmarker CD45 verwendet, um zum Abbau der normalen Zellpopulation von Leukozyten verwendet werden ^5.

Prostatakrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebs und eine Hauptursache der durch Krebs verursachten Todesfälle bei Männern ^6. Die Mechanismen der Tumorprogression und Aggressivität sind nicht vollständig verstanden, und deshalb die Erzeugung und Charakterisierung von experimentellen Modellen, die die molekulare Heterogenität von Prostatakrebs rekapitulieren sind von großem Interesse. PDX Modelle von Prostatakrebs wurden vorher durch Verpflanzung von menschlichen Prostatakrebszellen erzeugten immunocomversprach Mäusen ^7,8. Jedoch ist die Erzeugung solcher Modelle ist durch die geringe Transplantationsrate von Prostatakrebs in immungeschwächten Mäusen, die im Wesentlichen auf die träge Art der Krankheit zurückzuführen ist behindert. Kurzem CTCs wurden verwendet, um Brustkrebs ^9, Lungenkrebs und Prostatakrebs ^{10 11} PDX Modelle zu erzeugen. Diese Proof-of-Concept-Studien wurde die Möglichkeit eingeführt PDX-Modelle unabhängig von der Notwendigkeit eines chirurgischen Probensammlung zu erzeugen. In diesem Artikel beschreiben wir im Detail ein Verfahren zur Erzeugung dieser neuartigen experimentellen Modell.

Protocol

Dieses Protokoll wurde an unserer Hochschule mit Genehmigung durch die institutionellen Forschungsethikkommission durchgeführt und ist in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das menschliche Wohlergehen. 1. Erhebung der peripheren Blut von Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs Hinweis: Wählen Sie Patienten mit metastasierendem Prostatakrebs. Eine schriftliche Einwilligung des Patienten und notieren k…

Representative Results

Dieses Protokoll wird auf die Erzeugung von PDX-Modelle von isolierten CD45 negativen Prostatakrebs CTCs führen. Basierend auf der in unserem Protokoll verwendeten negativen Selektionsverfahrens ist es notwendig, um tote Zellen auszuschließen unter Verwendung von DAPI-Färbung. Der Prozentsatz von CD45-negativen Zellen durchflusszytometrisch erfasst ist variabel und hängt von der Tumorbelastung des Patienten (1A). Immunfluoreszenzfärbung von unsortierten Zellen mit CD45 und DAPI (Zellkerne identifiz…

Discussion

Diese Handschrift beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung von Prostatakrebs PDX Modelle CTCs. Die Verwendung von CTCs zur Erzeugung von PDX Modelle hat mehrere wichtige potenzielle Vorteile gegenüber bestehenden Verfahren. Zuerst zugängliche Sammlung von CTCs aus dem peripheren Blut ermöglicht die Erzeugung von experimentellen Modellen des gleichen Patienten in verschiedenen Krankheitsstadien. Zweitens stellt der Blutentnahme eine sicherere und kostengünstiges Verfahren, um Tumorzellen zu isolieren…

Materials

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2×2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 gauge needle
1 ml syringe