דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים
Summary
This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.
Abstract
Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.
Introduction
xenografts נגזר מטופל הם מודלים ניסיוניים יותר ויותר פופולריים המשמשים לחקר הסרטן. הם יכולים לשמש לאפיון של סמנים ביולוגיים ומסלולים ביולוגיים, הערכה טרום-קלינית של יעילות תרופה, ויצירה של avatars לטיפולים בסרטן אישית 1,2. בעבר, קבוצות מחקר אחרות פיתחו מודלים PDX או על ידי השתלה או הזרקת השעיות תא הסרטני בודדות או explants כל גידול לעכברים דיכוי חיסוני 1. PDX אלה מודלים דורשים אוסף כירורגית של גידול מוצק טרי, מיימת הממארת או תפליט פלאורלי ממטופל עובר הליך כירורגי שהוא גם יקר וחושף את המטופל לסיכון מוגבר לתחלואת iatrogenic.
התפתחות האחרונה משמעותית בחקר הסרטן כבר זיהוי, הבידוד ואפיון תאים סרטניים במחזור. תאים הסרטניים אלה לברוח ממסת הגידול הראשונית ולהיכנס במחזורשבו הם משחקים תפקיד קריטי בגרורות ולהרע, הגורם השכיח ביותר של סרטן הקשורים תמותה 3. ההערכה והאפיון של CTCs מכמה סוגים מוצקים גידול סיפקו מידע קליני לאבחון, פרוגנוזה, וניטור מחלת שייר 3. מגוון של גישות המשמשות כיום להסתמך על שני מאפיינים הפיזיים, הביטוי של סמנים ביולוגיים, או מאפיינים פונקציונליים של CTCs יכול לשמש כדי לבודד יעילות 4 CTCs. שיטות בידוד קיימים macroscale CTC כוללות צנטריפוגה צפיפות שיפוע, סינון פיזי עם נקבוביות מסנן והפרדה נגד מולקולות פני השטח. מתודולוגיות בידוד CTC הנפוצות ביותר מבוססות על לכידה מבוססת נוגדן של CTCs. שתי סלקציה חיובית ושלילית של סמנים פני התא יכולה להיות מועסק כדי לבודד CTCs מהדם היקפי. סלקציה חיובית לCTCs במחזור ההיקפי נפוצה משתמשת סמני אפיתל (למשל, EpCAM) שמחדש הביע בCTCs אבל תאים לא hematopoietic. החסרון של שיטה זו הוא שCTCs עם פוטנציאל גרורתי לעתים קרובות עבר אפיתל לmesenchymal מעבר (EMT), שdownregulates סמני משטח אפיתל 3. כדי לבודד CTCs עם פוטנציאל גרורתי, מתודולוגיה סלקציה שלילית המעסיקה את סמן משטח הדם, CD45, לרוקן את אוכלוסיית התאים הנורמלית של כדוריות דם לבנות ניתן להשתמש 5.
סרטן הערמונית הוא הסרטן הנפוץ ביותר שאובחן וגורם עיקרי למקרי מוות הקשורים לסרטן בגברים 6. המנגנונים של התקדמות גידול ותוקפנות אינם מובנות לחלוטין, ולכן הדור והאפיון של מודלים ניסיוניים כי לשחזר הטרוגניות המולקולרית של סרטן הערמונית הם עניין משמעותי. המודלים PDX של סרטן הערמונית היו נוצר בעבר על ידי קליטתם של תאי סרטן הערמונית אנושיים לimmunocomעכברים הבטיחו 7,8. עם זאת הדור של מודלים כאלה כבר הקשו על ידי השיעור הנמוך engraftment של סרטן הערמונית בעכברים דיכוי חיסוני, אשר נבע בעיקרו האופי העצל של המחלה. לאחרונה, CTCs כבר השתמש כדי ליצור סרטן השד 9, סרטן סרטן הריאות וערמונית 10 11 דגמי PDX. מחקרי הוכחה של קונספט אלה הציגו את האפשרות של יצירה עצמאי דגמי PDX של הצורך באיסוף דגימה כירורגית. במאמר זה אנו מתארים בפירוט שיטה לייצור מודל ניסיוני הרומן הזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מתאר שיטה לייצור המודלים PDX סרטן הערמונית מCTCs. השימוש בCTCs לדור של PDX יש דגמים כמה יתרונות חשובים פוטנציאליים בהשוואה לשיטות קיימות. ראשית, אוסף נגיש של CTCs מהדם היקפי מאפשר את הדור של דגמים ניסיוניים מאותו המטופל בשלבי מחלה שונים. שנית, איסוף דם מייצ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Jordi Ochando from the Flow Cytometry Shared Resources at the Mount Sinai Medical Center for their assistance in flow cytometry analysis. We thank Dr. Rumana Huq from the Microscopy Shared Resource Facility at the Mount Sinai Medical Center for their imaging assistance. The authors thank the TJ Martell Foundation for its support in this project.
Materials
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Cell Gro | 21-031-CM | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml polystyrene conical tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440 | |
| 12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA | |||
| BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge | |||
| BD Vacutainer One Use Needle Holder | |||
| Disposable Latex Tourniquet | |||
| Latex or non-latex gloves | |||
| alcohol swabs | |||
| 2×2 cotton gauze pads | |||
| Adhesive bandage | |||
| 25 gauge needle | |||
| 1 ml syringe |
Riferimenti
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer research. 73, 5315-5319 (2013).
- Joosse, S. A., Gorges, T. M., Pantel, K. Biology, detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO molecular medicine. 1, 1-11 (2014).
- Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).
- Liu, Z., et al. Negative enrichment by immunomagnetic nanobeads for unbiased characterization of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients. Journal of translational medicine. 9, 1-9 (2011).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics , 2013. CA: a cancer journal for clinicians. 63, 11-30 (2013).
- Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer cell. 22, 373-388 (2012).
- Klein, K. A., et al. Progression of metastatic human prostate cancer to androgen independence in immunodeficient SCID mice. Nature Medicine. 3, 402-408 (1997).
- Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nature medicine. 20, 897-903 (2014).
- Vidal, S., et al. A Targetable GATA2-IGF2 Axis Confers Aggressiveness in Lethal Prostate Cancer. Cancer cell. 27, 223-239 (2015).
- Quintana, E., et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature. 456, 593-598 (2008).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature. 17, 1514-1520 (2011).
