Generering av Prostate Cancer Patient Avledet xenotransplantat Modeller fra Sirkulasjonstumorceller

Summary

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Abstract

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

Introduction

Pasient avledet xenografts blir stadig mer populære eksperimentelle modeller som benyttes for kreftforskning. De kan brukes for karakterisering av biomarkører og biologiske pathways, pre-klinisk evaluering av legemidlets effekt, og etableringen av avatarer for personlig kreftbehandling ^1,2. Tidligere har andre forskningsmiljøer utviklet PDX modeller enten ved å implantere eller injisere enkelttumorcellesuspensjoner eller hele tumor eksplantater inn immunsupprimerte mus ^1. Disse PDX modeller krever kirurgisk samling av fersk solid tumor, maligne ascites eller plevravæske fra en pasient som gjennomgår et kirurgisk inngrep som er både kostbart og utsetter pasienten til økt risiko for iatrogen sykelighet.

En betydelig nyere utvikling i kreftforskning har vært deteksjon, isolering og karakterisering av sirkulerende tumorceller. Disse tumorceller flykte fra primærtumormasse og skriv sirkulasjonhvor de spiller en avgjørende rolle i metastase og tilbakefall, den vanligste årsaken til kreftrelatert dødelighet ^tre. Evalueringen og karakterisering av CTCS fra flere solide tumortyper har gitt klinisk informasjon for diagnose, prognose, og overvåke restsykdom ^tre. En rekke for tiden anvendte fremgangsmåter som baserer seg på enten den fysiske egenskaper, ekspresjon av biomarkører, eller funksjonelle egenskaper CTCS kan brukes for effektivt å isolere CTCS ^4. Eksisterende mesoklimatisk CTC isoleringsmetoder inkluderer tetthetsgradient-sentrifugering, fysisk filtrering med filterporene og separasjon mot overflatemolekyler. De mest brukte CTC isolasjon metoder er basert på antistoffbasert fangst av CTCS. Både positive og negative utvalg av celleoverflatemarkører kan anvendes for å isolere CTCS fra perifert blod. Positiv utvelgelse for CTCS i den perifere sirkulasjonen ofte bruker epiteliale markører (f.eks EpCAM) som enre uttrykt på CTCS men ikke hematopoetiske celler. Ulempen med denne metoden er at CTCS med metastatisk potensiale har ofte gjennomgått epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT), som nedregulerer epiteliale markører overflate ^3. For å isolere CTCS med metastatisk potensial, til en negativ seleksjon metode som anvender hematopoetiske overflatemarkør, CD45, utarme normal cellepopulasjon av leukocytter kan anvendes ^5.

Prostatakreft er den vanligste diagnosen kreft og en viktig årsak til kreft dødsfall hos menn ^6. Mekanismene for tumorprogresjon og aggressivitet er ikke helt forstått, og derfor generering og karakterisering av eksperimentelle modeller som rekapitulere den molekylære heterogenitet av prostatakreft er av betydelig interesse. PDX modeller av prostatakreft har vært generert tidligere av engraftment av menneskelige prostata kreft celler i immunocomlovet mus ^7,8. Imidlertid genereringen av slike modeller har vært hemmet av den lave innpoding frekvensen av prostatakreft i immunkompromitterte mus, som er i hovedsak knyttet til lat sykdommens art. Nylig har CTCS blitt brukt til å generere brystkreft ^9, lungekreft ¹⁰ og prostatakreft ¹¹ PDX-modeller. Disse proof-of-concept studier introduserte muligheten for å skape PDX modeller uavhengig av behovet for kirurgisk prøvetaking. I denne artikkelen beskriver vi i detalj en fremgangsmåte for generering av denne nye eksperimentelle modellen.

Protocol

Denne protokollen er blitt utført ved vår institusjon med godkjenning fra institusjonelle forskningsetiske styret og er i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd. 1. Innsamling av perifert blod fra pasienter med avansert prostatakreft Merk: Velg pasienter med metastatisk prostatakreft. Innhente skriftlig pasienten samtykke og registrere kliniske kjennetegn ved pasientene, inkludert alder på isolasjon o…

Representative Results

Denne protokollen vil føre til generasjon PDX modeller fra isolerte CD45 negative prostatakreft CTCS. Basert på det negative seleksjonsmetode som brukes i vår protokollen er det nødvendig å ekskludere døde celler ved å bruke DAPI flekken. Prosentandelen av CD45-negative celler detektert ved strømningscytometri er variabel og avhenger av tumorbelastning hos pasienten (figur 1A). Immuno-fluorescensfarging av usorterte celler ved hjelp av CD45 og DAPI (for å identifisere cellekjerner) avslører CD…

Discussion

Dette manuskriptet beskriver en metode for generering av prostatakreft PDX modeller fra CTCS. Bruken av CTCS for generering av PDX modellene har flere mulige viktige fordeler sammenlignet med eksisterende metoder. For det første muliggjør samling av tilgjengelige CTCS fra perifert blod generering av eksperimentelle modeller fra samme pasient ved forskjellige sykdomsstadier. Andre representerer blodoppsamlings en sikrere og billig metode for å isolere tumorceller sammenlignet med eksisterende metode…

Materials

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2×2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 gauge needle
1 ml syringe