Anställa Digital Droppe PCR för att upptäcka BRAF V600E Mutationer i formalinfixerade paraffininbäddade referensstandard cellinjer
Summary
Målet med den här videon är att visa hur man utför automatiserad DNA-extraktion från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) referensstandard cellinjer och digital droppe PCR (ddPCR) analys för att upptäcka sällsynta mutationer i en klinisk miljö. Detektion av mutationer i FFPE proven visar den kliniska nyttan av ddPCR i FFPE proven.
Abstract
ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.
Introduction
Ansamlingen av genetiska mutationer i viktiga reglerande gener förändrar normal cell programmering som celltillväxt, differentiering och överlevnad, vilket leder till cancer 1. RAS-RAF-MAP-kinasvägen förmedlar cellulära svar på tillväxtsignaler. Onkogen BRAF mutationer kan härröra från förare mutationer i BRAF-genen, vilket kan orsaka BRAF onkoprotein att bli överaktiv 2. Mutationer i BRAF-genen resulterar också i överaktiv nedströmssignalering via MEK och ERK 3, vilket i sin tur leder till överdriven celltillväxt och proliferation oberoende av tillväxtfaktorförmedlad reglering 4-6.
Flera verktyg finns tillgängliga för DNA-mutation profilering, såsom kvantitativa realtid BRAF V600E mutationer i formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) referensstandard cellinjer från ddPCR. ddPCR är en PCR-baserad metod för absolut kvantifieringerbjuder högre noggrannhet jämfört med konventionell kvantitativ realtids-PCR (qPCR) 7,8. ddPCR ger också högre upplösningsförmåga och noggrannhet för detektion av sällsynta mutationer i DNA-mallar, vilket möjliggör mer informativ cancerforskning och diagnos 9. Ytterligare fördelar med ddPCR jämfört med konventionell qPCR inkluderar dess ökad känslighet och precision när man studerar låg mall kopieantal 10-12. Häri är ett protokoll för automatisk extraktion av DNA från FFPE referensstandard cellinjer, följt av bestämning av närvaron eller frånvaron av BRAF V600E mutationer genom ddPCR påvisas. Användningen av programvara för dataanalys och en grafisk representation av resultaten beskrivs också. Hela förfarandet är relativt enkelt och helt beror på antalet prover som skall profilerade och antalet konventionella PCR och ddPCR automater.
Följande protokoll beskriver standardprocedurer för BR AF V600E-positiva FFPE referensstandard cellinjer (HD598, HD593, HD617, HD273 och vildtyp (WT)) utförs i ett helt automatiserat instrument med hjälp av Vävnadsberedning System (TPS) protokollet. Därefter isoleras DNA-prover analyserades för närvaro av BRAF V600E mutationer med användning ddPCR systemet. Riktad mutationsanalys utförs efter alla prover har profilerade och data har laddats in i dataanalys programvara. Beroende på antalet prover / grupper studerades, dataanalys kan kräva från en till flera timmar. Den experimentella komponenten av metodiken kräver noggrannhet i hanteringen DNA ochrological Pipetter och pipetter, en JUPITER Science Education video som förklarar mer om om ramen för pipettering "> pipett till 96 brunnar, medan dataanalys utförs med hjälp av programvara.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här lyfter vi tillämpligheten av ddPCR och isolering av DNA från FFPE referensstandard cellinje prover för en specifik gen mutation bedömning. I denna studie, är TPS automatiserad DNA isolering metod som lätt kan anpassas, automatiserad, och kan rymma upp till 48 olika prov samtidigt, vilket möjliggör större skaleförsök och lägre variabilitet. En av begränsningarna hos DNA-isolering i detta arbete är att varje FFPE provet är unik och kommer att variera en varandra i ytföroreningar, mikrobiell flora, och…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av FoU-program för samhället av National Research Foundation (NRF), som finansieras av ministeriet för vetenskap, IT & Framtid Planning (Grant nr 2013M3C8A1075908).
Materials
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
Riferimenti
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, ‘definetherain’. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943 (2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
