Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard
Summary
L'obiettivo di questo video è quello di dimostrare come eseguire l'estrazione del DNA automatizzato da inclusi in paraffina linee cellulari fissate in formalina (FFPE) di riferimento standard e delle gocce digitali PCR (ddPCR) analisi per individuare mutazioni rare in un ambiente clinico. Rilevamento mutazioni nei campioni FFPE dimostra l'utilità clinica di ddPCR in campioni FFPE.
Abstract
ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.
Introduction
L'accumulo di mutazioni genetiche nei principali geni regolatori altera programmazione cellula normale come la proliferazione cellulare, il differenziamento e la sopravvivenza, che porta al cancro 1. La chinasi RAS-RAF-MAP media le risposte cellulari ai segnali di crescita. Mutazioni BRAF oncogeno possono derivare da mutazioni del driver nel gene BRAF, che possono causare il BRAF oncoprotein a diventare iperattiva 2. Le mutazioni nel gene BRAF anche tradursi nella segnalazione a valle iperattiva tramite MEK e ERK 3, che, a sua volta, porta alla crescita eccessiva delle cellule e la proliferazione indipendentemente da fattore di crescita-mediata regolazione 4-6.
Sono disponibili diversi strumenti per la mutazione del DNA profiling, come ad esempio in tempo reale mutazioni BRAF V600E quantitativi fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) di riferimento standard di linee cellulari di ddPCR. ddPCR è un metodo basato sulla PCR per la quantificazione assolutaoffrendo una maggiore precisione rispetto ai tradizionali quantitativa real-time PCR (qPCR) 7,8. ddPCR fornisce anche una maggiore potenza e precisione la risoluzione per la rilevazione di mutazioni rare nei modelli di DNA, consentendo la ricerca sul cancro più informativo e la diagnosi 9. Ulteriori vantaggi di ddPCR oltre qPCR convenzionale sono la sua maggiore sensibilità e precisione quando si studia il numero di copie a basso modello 10-12. Qui, un protocollo per estrarre automaticamente DNA da linee cellulari normali riferimento FFPE, seguiti da determinare la presenza o l'assenza di mutazioni BRAFV600E da ddPCR è dimostrata. L'utilizzo di software per l'analisi dei dati e una rappresentazione grafica dei risultati sono anche descritti. L'intera procedura è relativamente semplice e totalmente dipende dal numero di campioni da profilati e il numero delle macchine convenzionali PCR e ddPCR disponibili.
Il protocollo che segue descrive le procedure standard per la BR AF-V600E positivi di riferimento FFPE linee di cellule normali (HD598, HD593, HD617, HD273 e di tipo selvatico (WT)) viene eseguita in uno strumento completamente automatico che utilizza il protocollo Tissue preparazione sistema (TPS). Successivamente, i campioni di DNA isolati vengono analizzati per la presenza di mutazioni BRAF V600E utilizzando il sistema ddPCR. Analisi mirata mutazione viene eseguita dopo tutti i campioni sono stati profilato e i dati sono stati caricati nel software di analisi dati. A seconda del numero di campioni / gruppi studiati, analisi dei dati può richiedere da una a diverse ore. Il componente sperimentale della metodologia richiede accuratezza nella gestione DNA erological Pipette e pipette, un video JOVE Scienze della Formazione spiegare di più sul contesto di pipettaggio "> pipettaggio in 96 pozzetti, mentre l'analisi dei dati viene eseguita utilizzando il software.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, si evidenzia l'applicabilità di ddPCR e isolamento del DNA da campioni di linee cellulari normali di riferimento FFPE una specifica valutazione mutazione del gene. In questo studio, TPS DNA metodo di isolamento automatico viene utilizzato, che può essere facilmente adattato, automatizzato, e può ospitare fino a 48 campioni diversi contemporaneamente, consentendo per esperimenti su scala più ampia e bassa variabilità. Uno dei limiti di isolamento del DNA nel presente lavoro è che ogni campione FFPE è unic…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di ricerca e sviluppo per la società della Fondazione Nazionale delle Ricerche (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, ICT & Future Pianificazione (Grant No. 2013M3C8A1075908).
Materials
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
Riferimenti
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