Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen
Summary
Dendritischen Dornen von Pyramidenneuronen sind die Websites der meisten Synapsen im Gehirn von Säugetieren Kortex. Diese Methode beschreibt ein 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien in der menschlichen kortikalen Pyramiden glutamatergen Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet.
Abstract
Dendriten sind kleine Vorsprünge, die mit den postsynaptischen Kompartimente von exzitatorischen Synapsen des zentralen Nervensystems zu entsprechen. Sie sind entlang den Dendriten verteilt sind. Ihrer Morphologie ist weitgehend abhängig von der neuronalen Aktivität, und sie dynamisch sind. Dendritenfortsätzen exprimieren glutamatergen Rezeptoren (AMPA und NMDA-Rezeptoren) auf ihrer Oberfläche und auf der Ebene der postsynaptischen Dichten. Jeder Dorn ermöglicht das Neuron seine staatlichen und lokalen Aktivität unabhängig zu steuern. Wirbelsäulen Morphologien wurden ausgiebig in glutamatergen Pyramidenzellen der Hirnrinde untersucht, wobei sowohl in-vivo-Ansätzen und neuronale Kulturen aus Nagetiergewebe erhalten. Neuropathologischen Bedingungen können zu veränderten Wirbelsäule Induktion und Reifung verbunden werden, weil in Nagetier kultivierten Neuronen und eindimensional quantitative Analyse. 1 gezeigt Die vorliegende Arbeit beschreibt ein Protokoll für die 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien mit menschlichen Cortial Neuronen aus neuralen Stammzellen (späten kortikalen Vorläuferzellen) stammt. Diese Zellen wurden ursprünglich von pluripotenten Stammzellen erhalten. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse der Wirbelsäule Morphologien bei unterschiedlichen Kulturperioden und mit möglichen Vergleich zwischen pluripotenten Stammzellen, die aus Kontroll-Individuen mit denen von Patienten mit psychiatrischen Erkrankungen erhalten wird.
Introduction
Dendritischen Dornen kortikaler Pyramidenzellen sind klein und dünn Vorsprüngen, die entlang der basalen und apikalen Dendriten dieser neuronalen Subtypen in Nagetier, Primaten und menschliche Gehirn verteilt sind. Sie sind die Websites der meisten Synapsen und Anzeige Tastenfunktionen beim Lernen und kognitive Prozesse. Die detaillierten Strukturen der menschlichen dendritischen Dornen wurden technisch durch Elektronenmikroskopie 2 untersucht. Allerdings ist eine solche Vorgehensweise zeitaufwendig und stellt hohe Arbeitsbelastung. In jüngerer Zeit hat eine dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Morphologie der dendritischen Dornen in menschlichen Hirnrinde mit spezifischer Software kombiniert werden, um große manuelle Wirbelsäulenanalyse 3 gemeldet.
Green Fluorescence Protein (GFP) Technologie, um Immun gekoppelt stellt ein genaues Werkzeug für die Wirbelsäulen Identifizierung und Formmessung durch Fluoreszenzmikroskopie. Diese Vorgehensweise kann leicht an kultivierten Neuronen angewendet werden. However, haben keine Angaben über die Analyse der Wirbelsäule Reifung und Morphologie auf die menschliche Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) abgeleitet gemeldet.
Das Ziel dieser Studie war es, ein Protokoll, das dendritischen Dorn Abbildungs aus kultivierten menschlichen Nervenzellen di vitro ermöglicht beschreiben. GFP-Markierung, die konfokale Mikroskopie und 3D-Analyse mit dem Filament Tracer-Modul von Imaris Software wurden in dem vorliegenden Protokoll verwendet. Kultur Schritte, die erforderlich sind, um kortikale glutamatergen Neuronen der Schichten II bis IV von neuralen Stammzellen (NSC) zu erhalten sind, sind auch hier kurz beschrieben. Das gesamte Protokoll für den menschlichen NSC Produktion hat bereits an anderer Stelle 4 veröffentlicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Quantifizierung der morphologischen Merkmale der Pyramidenneuronen stützte sich auf die Software. Das Filament Tracer Oberfläche wurde für die Segmentierung von Neuronen und Dorne verwendet, und die XT-Modul wurde für die Analyse verwendet.
Um die Genauigkeit der unsere Technik analysieren wir zunächst Vergleich der gemessenen morphologischen Parameter (Länge, Fläche, und die Gesamtmenge der Wirbelsäule, wenn zutreffend), mit denen veröffentlichte unter Verwendung von Ratten rei…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.
Materials
| PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o vit A (50X) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Pen-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
Riferimenti
- Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
- Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscienze. 145, 464-469 (2007).
- Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
- Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
- Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
- Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
- Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
- Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
- Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).
