La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas
Summary
Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas.
Abstract
Las espinas dendríticas son pequeñas protuberancias que corresponden a los compartimentos post-sinápticos de las sinapsis excitadoras en el sistema nervioso central. Se distribuyen a lo largo de las dendritas. Su morfología es dependiente en gran medida de la actividad neuronal, y son dinámico. Las espinas dendríticas expresan receptores glutamatérgicos (receptores AMPA y NMDA) en su superficie y en los niveles de densidades postsinápticas. Cada columna vertebral permite la neurona para controlar su actividad estatal y local de manera independiente. Morfologías la columna vertebral han sido ampliamente estudiados en las células piramidales glutamatérgicas de la corteza cerebral, el uso de ambos enfoques in vivo y cultivos neuronales obtenidas a partir de tejidos de roedores. Condiciones neuropatológicos pueden estar asociados a la inducción de la columna vertebral y la maduración alterada, como se muestra en roedores neuronas cultivadas y el análisis cuantitativo unidimensional 1. El presente estudio describe un protocolo para el análisis cuantitativo 3D de morfologías de columna usando cortic humanacol neuronas derivadas de células madre neurales progenitoras corticales (finales). Estas células se obtuvieron inicialmente a partir de células madre pluripotentes inducidas. Este protocolo permite el análisis de la morfología de la columna vertebral en diferentes períodos de la cultura, y con posibilidad de comparación entre las células madre pluripotentes inducidas obtenidos de individuos de control con los obtenidos a partir de pacientes con enfermedades psiquiátricas.
Introduction
Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales corticales son protuberancias pequeñas y delgadas que se distribuyen a lo largo de las dendritas basales y apicales de estos subtipos neuronales en los roedores, primates, y el cerebro humano. Son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras y mostrar funciones clave en el aprendizaje y los procesos cognitivos. Las estructuras detalladas de las espinas dendríticas humanas se han estudiado técnicamente por microscopía electrónica 2. Sin embargo, este enfoque lleva mucho tiempo y representa la carga de trabajo pesado. Más recientemente, un tridimensional (3D) de reconstrucción de la morfología de las espinas dendríticas ha sido reportado en la corteza del cerebro humano utilizando software específico combinado a gran análisis manual de la columna vertebral 3.
La tecnología verde proteína de fluorescencia (GFP) acoplado a inmunofluorescencia representa una herramienta precisa para la identificación de la columna vertebral y medición de la forma por microscopía de fluorescencia. Este enfoque se puede aplicar fácilmente a las neuronas cultivadas. However, no hay datos han sido reportados en el análisis de maduración de la columna vertebral y la morfología de las neuronas humanas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (IPSC).
El objetivo de este estudio fue describir un protocolo, que permite obtener imágenes de la espina dendrítica de las neuronas humanas cultivadas in vitro. Etiquetado GFP, microscopía confocal y análisis 3D con el módulo del filamento de marcador de software Imaris fueron utilizados en el presente protocolo. Cultura pasos que son necesarios para obtener neuronas glutamatérgicas corticales de las capas II a IV a partir de células madre neurales (NSC) son también brevemente descrito aquí. Todo el protocolo para la producción NSC humana ya ha sido publicado en otra parte 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cuantificación de las características morfológicas de las neuronas piramidales se basó en el software. La interfaz Filament trazador se utilizó para la segmentación de las neuronas y espinas, y el módulo XT se utilizó para su análisis.
Analizar la precisión de nuestra técnica, lo primero que comparó los parámetros morfológicos medidos (longitud, superficie, volumen y total de la columna vertebral en su caso), con los publicados utilizando ratas neuronas piramidales maduros e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.
Materials
| PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o vit A (50X) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Pen-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
Riferimenti
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