Hele Retinale Eksplantater fra kylling Embryoner til Elektroporation og kemisk reagens Behandlinger
Summary
Denne protokol beskriver en metode til at dissekere, eksperimentelt manipulere og kultur hele retinale eksplantater fra kylling embryoner. De eksplantatkulturer er nyttige, når høj succesrate, effektivitet og reproducerbarhed er nødvendige for at afprøve virkningerne af plasmider til elektroporering og / eller reagens stoffer, dvs. enzymatiske inhibitorer.
Abstract
Nethinden er en god model for udvikling af centralnervesystemet. Den store størrelse af øjet og vigtigst tilgængeligheden for eksperimentelle manipulationer i ovo / in vivo gør kyllingeembryoniske retina en alsidig og meget effektiv eksperimentel model. Selvom kyllingeretina er let at målrette in ovo ved intraokulær injektion eller elektroporation, kan den effektive og nøjagtige koncentration af reagenserne i nethinden være vanskeligt at fuldt kontrol. Dette kan skyldes variationer i stedet nøjagtige injektion, lækage fra øjet eller ujævn diffusion af stoffer. Endvidere hyppigheden af misdannelser og dødelighed efter invasive manipulationer såsom elektroporering er temmelig høj.
Denne protokol beskriver en ex ovo teknik til dyrkning af retinale hele eksplantater fra kyllingefostre og tilvejebringer en fremgangsmåde til kontrolleret eksponering af nethinden til reagenser. Protocol beskriver, hvordan at dissekere, eksperimentelt manipulere og kultur hele retinale eksplantater fra kylling embryoner. Eksplantaterne kan dyrkes i ca. 24 timer og underkastes forskellige manipulationer, såsom elektroporering. De vigtigste fordele er, at forsøget ikke er afhængig af overlevelsen af embryoet og at koncentrationen af det indførte reagens kan varieres og styres med henblik på at bestemme og optimere den effektive koncentration. Endvidere teknikken er hurtig, billig og sammen med dets høje eksperimentelle succesrate, sikrer reproducerbar resultater. Det skal understreges, at det tjener som et fremragende supplement til eksperimenter udført in ovo.
Introduction
Nethinden er en del af det centrale nervesystem og det er, med dens relative enkelhed og velkarakteriseret cellearkitektur, en populær model til undersøgelse af centralnervesystemet udvikling. Øjet kyllingefosteret er forholdsvis stor i forhold til resten af embryoet. Det er derfor let tilgængelig i ovo til forsøg manipulationer, såsom injektioner eller elektroporation, og tjener som et udmærket redskab til at få viden om retinal celle og udviklingsmæssige biologi in vivo. På trods af disse store fordele, kan overlevelsen af embryonerne være lav, når forsøgene er invasiv såsom med elektroporeringer, gentagne injektioner, eller kombinerede eksperimentelle manipulationer.
Elektroporering af DNA-plasmider i kyllingefosteret in ovo er en vigtig og veletableret teknik 1. Det giver mulighed for mærkning af neuroner, opsporing af celleskæbnen samt neuronale skrifter i den centrale Nervskellige, og det giver mulighed for ektopisk genekspression at analysere protein funktion in vivo. Teknikken har været anvendt til undersøgelser af neuralrøret 2, baghjerne 3 og 4 retina. Elektroporering af embryoniske retina in ovo har nogle eksperimentelle vanskeligheder, der er relateret til di vivo situationen. Positionen af øjet, på grund af den kraniale foldning af embryo, er relativt tæt på hjertet. Denne nærhed øger risikoen for hjertestop efter elektroporation, og risikoen stiger med alderen embryoet. Desuden at få adgang til øjet, er det nødvendigt at åbne embryonale membraner, hvilket øger risikoen for blødning, misdannelser og efterfølgende reduceret levedygtighed. Ved prøvning og optimere en ny DNA-plasmid ofte uden en kendt fænotypisk resultat, kan disse begrænsninger nedsætte effekten og effekt af fremgangsmåden selv for en erfaren eksperimentator. Som fremlagt i denne protokol, kulturen i whul retinal eksplantat, defineret som hele neurale nethinde med pigmentepithelet fjernet, er en effektiv metode, der supplerer in ovo metode.
Intraokulære injektioner af kemiske reagenser er forholdsvis let at udføre in ovo. Den effektive og nøjagtige koncentration af injicerede reagenser inden for neurale nethinde, kan imidlertid være vanskeligt at fuldt ud at kontrollere. Den injicerede volumen kan variere som følge af lækage og nøjagtige injektionsstedet kan påvirke både fordelingen af reagenset i øjet og diffusion gennem glaslegemet. Variabiliteten vil få store konsekvenser for fortolkningen af resultaterne, når dvs. en dosisresponskurve for et enzym-inhibitor bestemmes; især hvis virkningen er lille og tidsvindue af effekten er smal. Desuden kan kun et enkelt øje anvendes fra hver embryo ved udførelse in ovo forsøg på grund af potentielle systemiske effekter via blodstrømmenpå kontralaterale øje. Alder matching er vigtigt, når man studerer udvikling og individuel variation mellem behandlede og kontrol embryoer kan føre til yderligere eksperimentel variabilitet.
Af disse årsager blev en ex ovo metode baseret på retinale eksplantater fra kyllingembryoer udviklet, hvor neurale nethinde kan udsættes for en ensartet og kontrolleret forsøgsbetingelse in vitro. Denne protokol blev udviklet baseret på tidligere protokoller 5-9. Retinale eksplantater fra trin (st) 20 (embryonale dage [E] 3) til ST31 (E7) kyllingembryoer blev dissekeret, dyrket og elektroporeret med en defineret DNA-plasmid koncentration eller udsat for et medium indeholdende en defineret koncentration af en kemisk reagens. Protokollen præsenteres her er gennemført med succes i de seneste publikationer, ved hjælp af flere forskellige kemiske reagenser, herunder regulatorer af DNA-skader vej, såsom KU55933, SB 218078, og NSC 109555 ditosylate, og cellecyklus, såsom Cdk1 / 2-inhibitor III 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbejde præsenteres et detaljeret protokol for dissektion, elektroporation eller kemisk behandling, og dyrkning af hele retina eksplantater fra kylling embryoner. Denne protokol er nemt, hurtigt og giver mulighed for både en høj succesrate og reproducerbar resultater.
Elektroporering af hele retina eksplantater producerer store områder af celler, som udtrykker genkonstruktionen af interesse. Det er let at placere korrekt elektroderne og at blotlægge en b…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
Materials
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10xDPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μL pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 mL disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
Riferimenti
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
