Summary

Espianti di retina intero da pollo embrioni per trattamenti di elettroporazione e Agenti chimici

Published: September 30, 2015
doi:

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per analizzare, sperimentalmente manipolare e cultura interi espianti di retina di embrioni di pollo. Le culture espianto sono utili quando alto tasso di successo, l'efficacia e riproducibilità sono necessari per testare gli effetti di plasmidi per elettroporazione e / o di sostanze reagenti, vale a dire, gli inibitori enzimatici.

Abstract

La retina è un buon modello per il sistema nervoso centrale di sviluppo. Le grandi dimensioni degli occhi e, soprattutto, l'accessibilità per le manipolazioni sperimentali in ovo / in vivo rende il pollo retina embrionale un modello sperimentale versatile e molto efficiente. Anche se la retina pollo è facile bersaglio in ovo da iniezioni intraoculari o elettroporazione, la concentrazione efficace e precisa dei reagenti all'interno della retina può essere difficile da completamente il controllo. Ciò può essere dovuto a variazioni del sito di iniezione esatta, fuoriuscita dall'occhio o diffusione uniforme delle sostanze. Inoltre, la frequenza di malformazioni e mortalità dopo manipolazioni invasive come l'elettroporazione è piuttosto elevato.

Questo protocollo descrive un ex ovo tecnica per la coltura di espianti retinici interi da embrioni di pollo e fornisce un metodo per esposizione controllata della retina ai reagenti. Il protocol descrive come sezionare, sperimentalmente manipolare, e la cultura interi espianti di retina di embrioni di pollo. Gli espianti possono essere coltivate per circa 24 ore ed essere sottoposti a diverse manipolazioni come elettroporazione. I principali vantaggi sono che l'esperimento non dipende la sopravvivenza dell'embrione e che la concentrazione del reagente introdotto può essere variata e controllata al fine di determinare e ottimizzare la concentrazione efficace. Inoltre, la tecnica è rapida, economica e, insieme con il suo alto tasso di successo sperimentale, assicura riproducibile risultati. Va sottolineato che serve come un ottimo complemento per esperimenti eseguiti in ovo.

Introduction

La retina è parte del sistema nervoso centrale ed è, con la sua relativa semplicità e architettura cellulare ben caratterizzato, un modello popolare per lo studio dello sviluppo del sistema nervoso centrale. L'occhio dell'embrione di pollo è relativamente grande rispetto al resto dell'embrione. E 'quindi facilmente accessibile di ovo per manipolazioni sperimentali, come le iniezioni o elettroporazione, e serve come un ottimo strumento per acquisire conoscenze su cellule della retina e biologia dello sviluppo in vivo. Nonostante questi importanti vantaggi, la sopravvivenza degli embrioni può essere basso quando gli esperimenti sono invasivi come ad esempio con electroporations, iniezioni ripetute o manipolazioni sperimentali combinati.

Elettroporazione di plasmidi DNA nell'embrione di pollo in ovo è una importante e consolidata tecnica 1. Esso consente per l'etichettatura dei neuroni, tracciando del destino delle cellule, così come tratti neuronali nella NERV centroSistema di unità organizzative e permette per l'espressione genica ectopica di analizzare la funzione delle proteine ​​in vivo. La tecnica è stata utilizzata per gli studi di tubo neurale 2, romboencefalo 3, 4 e della retina. Elettroporazione di retina embrionale in ovo ha qualche difficoltà sperimentali che sono legati alla situazione in vivo. La posizione dell'occhio, a causa della piegatura craniale dell'embrione, è relativamente vicino al cuore. Questa vicinanza aumenta il rischio di arresto cardiaco dopo l'elettroporazione, e il rischio aumenta con l'età dell'embrione. Inoltre, per accedere l'occhio, è necessario aprire le membrane embrionali, aumentando così il rischio di sanguinamento, malformazioni e conseguente ridotta vitalità. Durante il test e l'ottimizzazione di un nuovo plasmide DNA spesso senza un risultato fenotipico noto, queste limitazioni possono diminuire l'efficacia e la potenza del metodo anche per un sperimentalista con esperienza. Come presentato in questo protocollo, la cultura del wespianto foro retina, definito come l'insieme retina neurale con dell'epitelio pigmentato rimosso, è un metodo efficace che completa l'approccio in ovo.

Iniezioni intraoculari di reagenti chimici sono relativamente facili da eseguire in ovo. Tuttavia, la concentrazione efficace e precisa dei reagenti iniettati all'interno della retina neurale può essere difficile controllare completamente. Il volume iniettato può variare a causa delle perdite e il luogo esatto di iniezione può influenzare sia la distribuzione del reagente all'interno dell'occhio e la diffusione attraverso il corpo vitreo. La variabilità avrà importanti implicazioni per l'interpretazione dei risultati, quando cioè una curva dose-risposta per un inibitore viene definito sulla; in particolare se l'effetto è piccola e la finestra temporale dell'effetto è stretta. Inoltre, solo un occhio può essere utilizzato da ogni embrione durante l'esecuzione in esperimenti ovo a causa di potenziali effetti sistemici attraverso il flusso sanguignosul occhio controlaterale. Età matching è importante quando si studia lo sviluppo e la variabilità individuale tra trattati e degli embrioni di controllo possono portare a ulteriore variabilità sperimentale.

Per queste ragioni, un ex ovo metodo basato su espianti retinici da embrioni di pollo è stato sviluppato, in cui la retina neurale può essere esposto ad una uniforme e controllato condizione sperimentale in vitro. Il presente protocollo è stato sviluppato sulla base di precedenti protocolli 5-9. Espianti di retina di fase (st) 20 (giorni embrionali [E] 3) a ST31 (E7) embrioni di pollo sono stati sezionati, colto e elettroporate con una concentrazione di DNA plasmidico definita o esposti ad un terreno contenente una concentrazione definita di un reagente chimico. Il protocollo presentato qui è stato implementato con successo in pubblicazioni recenti, utilizzando diversi reagenti chimici diversi, tra cui le autorità di regolamentazione della via danno al DNA, come KU55933, SB 218.078, e NSC 109555 Ditosylate, e il ciclo cellulare, come Cdk1 / 2 inibitore III 10,11.

Protocol

Questo protocollo è eseguita in conformità con le raccomandazioni nella "Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dell'Associazione per la ricerca in visione e oculistica". 1. Manipolazione Uovo e la raccolta degli occhi Conservare le uova bianche Livorno a 12-14 ° C per non più di 1 settimana. Se disponibile, utilizzare un dispositivo di raffreddamento di vino refrigerato per conservare le uova fecondate. Nota: temperatura del serbatoio pi?…

Representative Results

Questo protocollo descrive la preparazione (Figura 1A-F) e coltura di espianti retinici interi da embrioni di pollo. Questo protocollo è stato usato con successo per interi espianti di retina da embrioni di ST20 (E3) a ST31 (E7). Elettroporazione di plasmidi DNA in tutto espianti di retina permette per l'etichettatura e la tracciabilità delle cellule progenitrici della retina o sovra-espressione di diversi prodotti genici. Per gli esperimenti di elettroporazione, l&#39…

Discussion

In questo lavoro viene presentato un protocollo dettagliato per la dissezione, elettroporazione o trattamento chimico, e la coltura di interi espianti di retina di embrioni di pollo. Questo protocollo è facile, veloce e consente sia un alto tasso di successo e riproducibile risultati.

Elettroporazione di interi espianti retinici produce grandi aree di cellule che esprimono il costrutto gene di interesse. È facile posizionare correttamente gli elettrodi e di esporre una p…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.

Materials

1xPBS (tablet) Life technologies 18912-014
10xDPBS Life technologies 14080-048
100 mm Petri dish VWR 734-0006
100 μL pipette tips VWR 613-0798
1.5 mL disposable plastic cuvette Thomas Scientific 8495V01
24-well plate Sigma Aldrich D7039
35 mm Petri dish VWR 391-1998
70% ethanol Solveco 1054
Cdk1/2 inhibitor III 217714 Calbiochem 300nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator Thermo Forma
Dissecting microscope Leica
DMEM Life Technologies 41966-029
Electrodes Platina, custom made
Electro square porator ECM 830 Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix Life Technologies 31331-028
FBS Life Technologies 16140-071
Forceps AgnThos 0108-5-PS
Freezing medium NEG50 Cellab, Sweden 6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany 8204
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
L-glutamine Life Technologies 25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI Life Technologies P36935
Paraffin film VWR 291-1214P
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold  Sigma Aldrich E6032
Penicillin streptomycin Life Technologies 15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)  Millipore 06-570 Dilution 1/4000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles") Sargenta 390-R (rondeller) Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes  Sonidel CUY700P4L Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette VWR 612-2853
Rotator shaker VWR 444-2900
Small spoon VWR 231-2151
Sucrose VWR 443815S
White Leghorn eggs Local supplier
Wine cooler WineMaster 24, Caso, Berlin Germany

Riferimenti

  1. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
  2. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
  3. Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
  4. Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
  5. Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
  6. Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
  7. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
  8. Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
  9. Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
  10. Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
  11. Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
  12. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
  13. Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
  14. Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
  15. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).

Play Video

Citazione di questo articolo
Shirazi Fard, S., Blixt, M., Hallböök, F. Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments. J. Vis. Exp. (103), e53202, doi:10.3791/53202 (2015).

View Video