Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.
Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples.
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as α-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.
ההצטברות של amyloids טאו תאיים מגדירה tauopathies כגון מחלת אלצהיימר. בשלבים המוקדמים של מחלה, פתולוגיה בדרך כלל מקומית לאזורים הנפרדים של המוח, אך עם התקדמות מחלה, פתולוגיה תמיד מתפשטת לאורך רשתות עצביות שונות 1-5. ראיות מצטברות מצביעות על התפשטות transcellular של אגרגטים חלבון רעילים בבסיס הפתולוגיה זה (שנסקר ב6-10). במודל זה, זרעי proteopathic (למשל, באוניברסיטת תל אביב) משתחררים מתאי תורם ולהיכנס תאי שכנים, הפיכת חלבון טאו ילידים לטופס misfolded באמצעות שינוי קונפורמציה בתבניות 11-15. Assay המתואר כאן פותח כדי לזהות פעילות זריעה כגון רגישות. זה תואם עם חלבון רקומביננטי ודגימות ביולוגיות ומאפשר כימות של רמות דקות של פעילות זריעת proteopathic 16.
תאי HEK 293T שיציבות להביע ד חוזר טאוomain (RD) המכיל את המוטציה P301S הקשורים למחלות התמזגו או CFP או YFP (להלן כתאי טאו-RD-CFP / YFP) לשמש כbiosensor יציב של פעילות זריעה. בהעדר זרעי proteopathic, התאים לשמור על טאו כמונומר מסיס, ואין להם סריג רקע ניכר. ספיגה ספונטנית או התמרה תיווך liposome של זרעי טאו לתאים, עם זאת, תוצאות בRD-CFP וצבירת RD-YFP, אשר מייצר אות סריג שנמדד בתוך תאים בודדים באמצעות cytometry זרימה.
רכיבים רבים של assay זה הונדסו כדי לשפר את הרגישות ולהפחית השתנות. שורת תאים חד שבטי עם יחס של 1: ביטוי RD-CFP / YFP 1 נבחרה, כפי שהיא מספקת אות אופטימלית: רעש. כדי להגביר את הרגישות, פוספוליפידים משמשים להציג זרעים ישירות לתוך תאים (למרות ללמוד מנגנונים ביולוגיים של ספיגה, זה יכול להיות מושמט). לבסוף, cytometry זרימת צגי סריג ברמת אוכלוסייה ותא בודד רמה, שלא כמו מבחני צבירת חלבון אחרים. מדד התוצאה הסופי, צפיפות סריג משולבת, היא כמותי מאוד והחשבונות הן למספר תאים עם צבירה, והמידה שבה צבירה התרחשה בתוך כל תא. כל פרמטרים האופטימליים אלה לשפר את הרגישות ולהבטיח שחזור.
מערכת זו הועסקה לאחרונה במחקר מקיף בעכברים מהונדסים tauopathy P301S 17 שהעריך את תחילת הזמן והתקדמות של פעילות ביחס זריעת טאו לסמנים פתולוגיים טאו הנפוץ אחרים (לדוגמא, MC1, AT8, PG5, וThioflavinS). פעילות זריעה היא רחוקה סמן המוקדם וחזק ביותר של פתולוגיה באוניברסיטת תל אביב העריך, שקדמו לגילוי היסטולוגית על ידי לפחות 6 שבועות. פעילות זריעה מופיעה ב 1.5 חודשים ועליות בהדרגה עם גיל, מה שמרמז תפקיד סיבתי של זרעי proteopathic בתחילה ו / או ההתקדמות של ניוון מוחיים 16.
e_content "> כימות מדויק של רמות דקות של חומר זרע מדגימות ביולוגיות יכול להקל על מחקרים העוקבים אחר התקדמות מחלה מוקדמת. על ידי קיצור משך משפט ומאפשר שימוש בבעלי החיים צעירים, זה יכול להגביר את היעילות והדיוק של ניסויים בבעלי חיים פרה-קליניים. לדוגמא, ב עכבר P301S שתואר קודם לכן, תרכובות עופרת יכולות להיות מועברות מוקדם ככל 4-6 שבועות (מייד לפני, או בתחילתה של פעילות זריעה), ופיקוח על יעילות 2-4 שבועות לאחר מכן. assay צריך במדויק לכמת הפחתה כלשהי בזריעה פעילות. סריג cytometry זרימה שניתן לבדוק במבחנה יישומי הקרנה גם כן. לדוגמא, ריאגנטים אנטי-טאו (למשל, נוגדנים, מולקולות קטנות, וכו ') במהירות ליכולתם לחסום זריעת אינדוקציה ישירות בתרבות, או באמצעות טאו רקומביננטי אגרגטים או lysates נגזר מוח כמקור זרע (איור 5). עם התקנה זו, מהרגע שחומר זרע מוכן, לשעברperiment לוקח רק שלושה ימים כדי להשלים, כולל ניתוח נתונים. הכימות המהיר של פעילות זריעת proteopathic יכול כך להקל על מחקרים רבים של ניוון של מערכת עצבים.מערכת cytometry זרימת סריג המתוארת כאן היא כלי רב עוצמה להערכת פעילות זריעת טאו במהירות ובכמותית. זה דורש רק ניסיון מתון תרבית תאים וידע בסיסי של סריג וcytometry זרימה. מבחני זריעה אחרים, כגון Thioflavin T – אשר מציגה משופר הקרינה כאשר חייב מבנה גיליון בטא – הם מייגע ודורשים מצע חלבו?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).
TBS | Sigma | T5912 |
cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 |
Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 |
Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU |
Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 |
15 mL conical tube | USA Scientific | 1475-0501 |
Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 |
Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 |
2-Propanol | Fisher Scientific | A451 |
Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 |
Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 |
1.5 mL tubes | USA Scientific | 1615-5510 |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 |
DPBS | Life Technologies | 14190-136 |
DMEM | Life Technologies | 11965-084 |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
50 mL Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 |
25 mL reagent resevoirs | VWR | 41428-954 |
Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 |
96 well flat bottom plates | Corning | 3603 |
Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
96 well round bottom plates | Corning | 3788 |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 |
PBS | Sigma-Aldrich | P5493 |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS |
HBSS | Life Technologies | 14185-052 |
Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 |
BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 |
Hemacytometer | VWR | 15170-172 |
MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 |
Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 |
Flow Jo analysis software | Flow Jo | |
20 uL pipet tips | Rainin | GPS-L10 |
200 uL pipet tips | Rainin | GPS-250 |
1 mL pipet tips | Rainin | GPS-1000 |
200 uL pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 |
5 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 |
10 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 |
25 mL Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |