Sensitive Påvisning av Proteopathic Seeding aktivitet med FRET flowcytometrisystemer
Summary
Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.
Abstract
Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples.
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as α-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.
Introduction
Den intracellulære akkumulering av tau amyloids definerer tauopatier, for eksempel Alzheimers sykdom. I tidlige sykdomsstadier, er patologi generelt lokalisert til diskrete regioner av hjernen, men med sykdomsprogresjon, patologi alltid spres langs adskilte nevrale nettverk 1-5. Akkumulere bevis tyder transcellulær spredning av giftige proteinaggregater ligger til grunn for denne patologi (anmeldt i 6-10). I denne modellen er proteopathic frø (f.eks tau) løslatt fra donorceller og skriv naboceller, trans innfødte tau protein i misfolded form via malbasert konformasjonsendringen 11-15. Analysen som beskrives her ble utviklet for å detektere en slik omhyggelig seeding aktivitet. Den er kompatibel med rekombinant protein og biologiske prøver og muliggjør kvantifisering av liten grad av proteopathic seeding aktivitet 16.
HEK 293T celler som stabilt uttrykker tau gjenta domain (RD) inneholdende det sykdomsassosierte P301S mutasjon fusjonert til enten CFP eller YFP (heretter kalt tau-RD-CFP / YFP celler) tjener som en stabil biosensor for såing aktivitet. I fravær av proteopathic frø, cellene opprettholde tau som et oppløselig monomer, og har ingen nevneverdig bakgrunn FRET. Spontan opptak eller liposom-mediert transduksjon av tau-frø i celler, resulterer imidlertid i RD-CFP og RD-YFP aggregering, som frembringer et FRET signal som er målt i løpet av enkeltceller via flowcytometri.
Mange komponenter av denne analysen ble konstruert for å øke følsomheten og redusere variabilitet. Et monoklonalt cellelinje med en 1: 1 RD-CFP / YFP uttrykk ratio ble valgt, da det gir optimal signal: støy. For å øke sensitiviteten, blir fosfolipider anvendt for å innføre frø direkte inn i cellene (selv om å studere biologiske mekanismer for opptak, kan dette utelates). Endelig flowcytometri skjermer FRET på befolkningsnivå og en enkelt celle nivå, i motsetning til andre protein aggregasjon analyser. Det endelige endepunktet, integrert FRET tetthet, er meget kvantitativ og står både for antall celler med aggregering, og i hvilken grad aggregering har forekommet i hver celle. Alle disse parameterne er optimalisert øke følsomheten og sikre reproduserbarhet.
Dette systemet ble nylig ansatt i en omfattende studie i transgen P301S tauopati mus 17 som evaluerte den timelige utbruddet og progresjon av tau seeding aktivitet i forhold til andre brukte tau patologiske markører (f.eks MC1, AT8, PG5 og ThioflavinS). Seeding aktivitet er langt den tidligste og mest robuste markør av tau patologi evaluert, foregående histologisk påvisning av minst 6 uker. Seeding aktivitet vises på 1,5 måneder og øker gradvis med alderen, noe som tyder på en årsaks rolle proteopathic frø i utbruddet og / eller progresjon av neurodegenerasjon 16.
e_content "> Presis kvantifisering av liten grad av frø materiale fra biologiske prøver kan tilrettelegge studier som overvåker tidlig sykdomsutvikling. Ved å forkorte rettssaken varighet og muliggjør bruk av yngre dyr, kan dette øke effektivitet og nøyaktighet prekliniske dyreforsøk. For eksempel i den P301S mus som tidligere er beskrevet, kan blyforbindelser leveres så tidlig som 4-6 uker (umiddelbart før eller ved inntreden av poding aktivitet) og overvåket med hensyn til effektivitet 2-4 uker senere. Analysen bør nøyaktig kvantifisere eventuelle reduksjoner i seeding aktivitet. FRET flowcytometri har in vitro screening programmer også. For eksempel kan anti-tau-reagenser (f.eks, antistoffer, små molekyler, etc.) kan testes for sin evne til hurtig å blokkere såing induksjon direkte i kultur, ved hjelp av enten rekombinant tau aggregater eller hjerne-avledet lysater som et frø kilde (figur 5). Med dette oppsettet, når frø materiale fremstilles, en exForsøket tar bare tre dager å fullføre, herunder dataanalyse. Den raske kvantifisering av proteopathic seeding aktivitet kan dermed legge til rette for mange studier av neurodegeneration.Protocol
Representative Results
Discussion
Den FRET flowcytometri system som er beskrevet her er et kraftig verktøy for hurtig og kvantitativ vurdering av tau seeding aktivitet. Det krever bare moderat cellekultur erfaring og relevant kunnskap om gnage og flowcytometri. Andre seeding assays, for eksempel Thioflavin T – som utviser forbedret fluorescens når de er bundet til beta sheet struktur – er arbeidskrevende og krever en ren, rekombinant protein substrat. I tillegg har in vitro-analyser for planting tau er bare semi-kvantitative og generelt uføl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).
Materials
| TBS | Sigma | T5912 |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 |
| 15 mL conical tube | USA Scientific | 1475-0501 |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 |
| 1.5 mL tubes | USA Scientific | 1615-5510 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| 50 mL Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 |
| 25 mL reagent resevoirs | VWR | 41428-954 |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | |
| 20 uL pipet tips | Rainin | GPS-L10 |
| 200 uL pipet tips | Rainin | GPS-250 |
| 1 mL pipet tips | Rainin | GPS-1000 |
| 200 uL pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 |
| 5 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 |
| 10 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 |
| 25 mL Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
Riferimenti
- Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
- Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
- Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer’s disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
- Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Cellular mechanisms of protein aggregate propagation. Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).
- Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
- Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
- de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer’s Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
- Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).
- Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 .
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
- Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
- McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
- Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).
- Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer’s Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochimica. , (2013).
- Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537 (2015).
