Microperfusion Technique å etterforske Regulering av microvessel Permeabilitet i Rat mesenterium

Summary

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Abstract

Eksperimenter for å måle permeabilitet egenskaper individuelt perfuserte microvessels gi en bro mellom etterforskning av molekylære og cellulære mekanismene som regulerer vaskulær permeabilitet i dyrkede endotelceller cellemonolag og funksjonelle utvekslings egenskapene til hele mikrovaskulære senger. En fremgangsmåte for å cannulate og perfuse venular microvessels av rotte mesenteriet og måle den hydrauliske ledningsevnen til microvessel vegg er beskrevet. De viktigste utstyret som trengs inkluderer en intra mikroskop med en stor modifisert scene som støtter micromanipulators å plassere tre forskjellige Mikro: (1) en skrå glass mikropipette til cannulate og perfuse den microvessel; (2) en glassmikrosperreinnretningen for å blokkere forbigående perfusjon og muliggjøre måling av transvascular vannstrømmen bevegelse ved et målt hydrostatisk trykk, og (3) en butt glasstav for å stabilisere den mesenteriske vev på stedet av kanylering. Den modifiserte Landis mikro-okklusjon technique benytter røde celler suspendert i kunstig perfusatet som markører for transvascular fluidbevegelse, og også gjør det mulig gjentatte målinger av disse strømmene som forsøksbetingelsene endres, og hydrostatiske og kolloid osmotisk trykkforskjell på tvers av mikrokar er nøye kontrollert. Målinger av hydraulisk ledningsevne først ved hjelp av en kontroll perfusatet, deretter etter re-kanylering av samme microvessel med test perfusates muliggjør sammenkoblet sammenligninger av microvessel responsen under disse godt kontrollerte forhold. Forsøk på å utvide metoden til mikrokar i mesenteriet av mus med genetiske modifikasjoner antas å modifisere vaskulær permeabilitet var sterkt begrenset på grunn av fraværet av lange, rette og forgrenede mikrokar i mus mesenteriet, men den siste tilgjengeligheten av rotter med tilsvarende genetiske modifikasjoner ved hjelp den CRISPR / Cas9 teknologi forventes å åpne nye områder av etterforskningen hvor metodene som er beskrevet her kan brukes. </p>

Introduction

Microperfusion i vaskulaturen omfatter å opprette kontrollert strøm av en kunstig perfusat av kjent sammensetning ved hjelp av en mikropipette i et blodkar vanligvis mindre enn 40 mikrometer i diameter. Den perfundert skipet oppholder seg innenfor sin normale vev miljø og er dynket med dyrets blod opp til tidspunktet for kanylering. Når den brukes sammen med en rekke videobilled eller fluorometriske metoder, in situ microperfusion muliggjør måling av vann og oppløste strømmer på tvers av veggene i mikrokar under betingelser hvor drivkreftene for disse strømmer er kjent og permeabilitetsegenskaper i den vaskulære veggen kan bli direkte evaluert. Videre, ved å kontrollere sammensetningen av væsken som omgir microvessel i vevet (perfusatet og superfusate), regulering av microvessel permeabilitet og utveksling kan bli undersøkt ved å aktivere endotelcellene som danner microvessel veggen å bli utsatt for en rekke experimental forhold (agonister, modifiserte perfusjon forhold, fluorescerende indikatorer for å måle intracellulær sammensetning og signalering) for nøyaktig målt perioder (sek til hr). Dessuten kan ultra eller cytokjemiske evalueringer av viktige cellulære molekylære strukturer som regulerer barrieren skal undersøkes i de samme microvessels hvor permeabiliteten er direkte måles. Tilnærmingen dermed danner en bro mellom etterforskning av de cellulære og molekylære mekanismer for å endre endothelial barrierefunksjon i dyrkede endotelceller cellemonolag og etterforskning i intakte microvessels. Se følgende anmeldelser for videre evaluering ^1-6.

En begrensning av microperfusion er at den bare kan brukes i mikrovaskulære senger som er tynn, transparent og har tilstrekkelig strukturell integritet til å muliggjøre kanylering med et glass mikropipette. Mens tidlige undersøkelser brukes frosk microvessels i mesenteriet og tynn hud pectoris muscle ^7,8, den klart mest brukte preparatet i pattedyr modeller er rotte mesenterium ^9-15. De fleste undersøkelser har fokusert på akutte endringer i vaskulær permeabilitet studert over perioder på 1-4 timer, men nyere undersøkelser har blitt utvidet til målinger på enkelte skip av 24-72 timer etter en innledende perfusjon ^12,16. Den nylig utviklet CRISPR teknologi, som lover å gjøre mer genmodifiserte rottemodeller tilgjengelig for å studere regulering av vaskulær permeabilitet ¹⁷ bør gjøre det mulig metodene beskrevet i denne kommunikasjonen som skal anvendes i venular microvessels av mesenteriet i disse viktige nye rottemodeller.

Metoden krever et invertert mikroskop utstyrt med en tilpasset bygget objektbord stor nok til å holde både dyr preparatet og minst tre micromanipulators anvendes for å posisjonsMikro nær perfusert fartøyet og for å justere en perfusjon mikropipette med fartøyetlumen. For eksempel en tilpasset plattform for et xy mikroskop scenen (ca 90 × 60 cm) kan fremstilles av en 1 cm tykk stålplate med en rust belegg. Scenen er festet til en ingeniør indeks tabell eller to due-tail slides montert i rett vinkel og støttes på Teflon søyler eller ball overføringer for bevegelse i horisontalplanet. En typisk rigg (se figur 2) har mye til felles med mikroskop og mikroposisjonering utstyr som brukes for en rekke intravital mikrosirkulasjon eksperimenter slik som de for å måle ett fartøy blodstrøm og hematokrit, lokal oksygentilførsel ved blod perfundert mikrokar, regulering av vaskulær glatt muskeltonus, og den lokale mikrovaskulær akkumulering av fluorescerende tracere injiseres i hele omløp. ^18-26

Den grunnleggende trekk ved den teknikk som er måling av volumstrømmen (J _v) over et definert overflateareal (S) av microvessel veggen. Å oppnådette via den modifiserte Landis teknikk som er beskrevet heri en enkel invertert mikroskop er tilstrekkelig. En liten video kameraet er montert på bildet port og videosignalet, med en ekstra gang base, vises på en videoskjerm og registreres enten i digital form på en datamaskin eller som en digital eller analog signal på en videoopptaker. Når microvessel kanyleres den del av microvessel synlig for kameraet, kan endres ved å bevege scenen og manipulatorer som en enhet uten å forstyrre kanylering.

Måling av transvascular strømmer kan også kombineres med mer detaljerte undersøkelser ved hjelp av en sofistikert fluorescensmikroskop med passende filtre som rigger som brukes for måling av oppløst stoff permeabilitet, fluorescerende forholdet overvåking av cytoplasmisk kalsium eller andre cellulære mekanismer, og konfokalt avbildnings ^{6,12,13, 27.} En viktig fordel med alle microperfusion tilnærminger er evnen til å gjøre gjentatte tiltak, på samme fartøyUnder kontrollert endring av drivkraften som hydrostatiske og kolloidosmotiske press, eller indusert endring i fartøy svar på betennelsestilstander. Den mest vanlige utforming er en sammenkoblet sammenligning av målt hydraulisk ledningsevne (L _p) på samme fartøy med fartøyet første perfuseres via en mikropipette fylt med en kontroll perfusatet og den røde cellesuspensjonen for å etablere en basislinje permeabilitet tilstand, og deretter med en andre pipette med testmidlet tilsatt til perfusatet. Flere cannulations er mulig med syklusen gjentas etter reperfusjon med kontroll pipette.

Den foreliggende protokoll demonstrerer kanylering og microperfusion av en venular fartøy i rotte mesenteriet til å ta opp vann flukser på tvers av microvessel veggen og måle L _{p av} karveggen, en nyttig indeks av permeabiliteten til felles bane for vann og oppløste stoffer på tvers av intakt endothelial barriere. Fremgangsmåten blir kalt den modifiserte Landis technique fordi den opprinnelige Landis prinsippet om å bruke den relative bevegelse av røde blodceller som et mål på transvascular fluid utveksling etter perfusjon blokkert er bevart ^28, men omfanget av eksperimentelle betingelser (for eksempel, hydrostatiske og albumin kolloidosmotiske trykkforskjeller på tvers av microvessel veggen) tilgjengelig etter microperfusion er langt større enn i uncannulated blod perfusert microvessels ^8,29.

Protocol

Etikk Uttalelse: Alle prosedyrer ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité. 1. Innledende Fabrikasjon av Mikropipetter, Restrainers, og stopper Trekk flere rene borsilikatglass kapillarrør i halvparten ved hjelp av en elektronisk avtrekker justeres slik at, når trukket, er det strukkede parti av røret omtrent 1 cm i lengde, og de to halvdelene er noe symmetrisk. Sørg for at taper er i samsvar med målene i figur 1. Bruk begge om…

Representative Results

Figur 4 viser resultater fra måling av tidsforløpet for forandringer i L p i en rotte venular microvessel kanylert suksessivt med fire perfusates. 33 Størrelsen av L p beregnes ved et konstant trykk ble benyttet som mål på endringer i microvessel vegg permeabilitet, først i styretilstand med et perfusat inneholdende 1% bovint serum albumin og når fartøyet er utsatt for inflammatorisk middel bradykinin (BK) ved hjelp av en mikropipette andre inneholdende 10 nM Bk….

Discussion

Detaljer angå L beregninger _s. Selv om transvascular bevegelse fluid inntreffer mens fartøyet fritt perfundert, er en slik utveksling langt for små til å måles ved fri perfusjon, fordi det normalt er mindre enn 0,01% av fartøyets perfusjonshastighet. Men når perfusjonen blir forbigående stoppet ved okkludering av den microvessel, transvascular strømning (dvs. filtrering) måles fra bevegelsen av markør røde celler i lumen som søylen av fluid mellom en markør av røde blodlegemer…

Materials

MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform–1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio–generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray–needs cord and controller–240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope–see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back–can be purchased from Amazon