Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

Summary

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Abstract

Experimenten om de permeabiliteit eigenschappen individueel geperfundeerde microvaatjes meten een brug slaan tussen onderzoek naar de moleculaire en cellulaire mechanismen reguleren van vasculaire permeabiliteit in gekweekte endotheliale cel monolagen en de functionele eigenschappen van uitwisseling gehele microvasculaire bedden. Werkwijze voor canule en perfuseren venulaire haarvaten van rat mesenterium en meet de doorlatendheid van het microvaatje wand wordt beschreven. De belangrijkste apparatuur die nodig is voorzien van een intravitale microscoop met een grote aangepaste stadium dat micromanipulators ondersteunt drie verschillende Microtools positioneren: (1) een afgeschuinde glas micropipet om canule en perfuseren de microvessel; (2) een glazen micro-occlusie te transient blokkeren perfusie en maken meting van transvasculaire waterstroom beweging bij een gemeten hydrostatische druk, en (3) een stompe glasstaaf de mesenteriale weefsel stabiliseren op de plaats van de canule. De gemodificeerde Landis micro-occlusie technique gebruikt rode cellen gesuspendeerd in kunstmatige perfusaat als markers van transvasculaire vloeiende beweging, en ook maakt herhaalde metingen van deze stromen als experimentele omstandigheden worden gewijzigd en hydrostatische en colloïd osmotische drukverschil over de microvaatjes worden zorgvuldig gecontroleerd. Metingen van doorlatendheid eerste gebruik van een controlegroep perfusaat, dan na opnieuw canulatie van dezelfde microvessel met de test perfusates vrijgave gepaarde vergelijkingen van de microvessel respons onder deze goed gecontroleerde omstandigheden. Pogingen om de methode uit te breiden tot bloedvaten in het mesenterium van muizen met genetische modificaties wordt naar vasculaire permeabiliteit modificeren waren ernstig beperkt door het ontbreken van lange rechte en onvertakte microvaatjes in de muis mesenterium, maar de recente beschikbaarheid van de ratten met gelijke genetische modificaties behulp het CRISPR / Cas9 technologie zal naar verwachting nieuwe gebieden van onderzoek, waar de hierin beschreven methoden kunnen worden toegepast openen. </p>

Introduction

Microperfusion in het vaatstelsel inhoudt vaststelling gecontroleerde stroom van een kunstmatige perfusaat van bekende samenstelling via een micropipet in een bloedvat gewoonlijk minder dan 40 micrometer in diameter. De geperfuseerde vaartuig blijft in zijn normale omgeving en weefsel wordt geperfuseerd met bloed van het dier tot het moment van de canule. Bij gebruik in combinatie met een reeks van videobeelden of fluorometrische technieken in situ microperfusion maakt meting van water en opgeloste stof stroomt over de wanden van kleine bloedvaten onder omstandigheden waarbij de drijvende krachten van deze stromen zijn bekend en de permeabiliteit eigenschappen van de vaatwand kan worden direct geëvalueerd. Verder, door het regelen van de samenstelling van de vloeistof rond het microvaatje in het weefsel (perfusaat en superfusate), de regulering van microvaatje permeabiliteit en uitwisseling kan worden onderzocht doordat de endotheelcellen die het microvaatje wand te worden blootgesteld aan diverse eXperimental voorwaarden voor nauwkeurig gemeten tijd (sec HR) (agonisten, gewijzigde perfusie voorwaarden, fluorescerende indicatoren intracellulaire samenstelling en signalering te meten). Bovendien kunnen ultrastructurele of cytochemische evaluaties van belangrijke cellulaire moleculaire structuren reguleren van de barrière onderzocht in dezelfde microvaatjes waarin doorlaatbaarheid wordt direct gemeten. De benadering vormt aldus een brug tussen onderzoek naar de cellulaire en moleculaire mechanismen die endotheliale barrièrefunctie passen in gekweekte endotheliale monolagen en onderzoek intacte microvaatjes. Bekijk de volgende beoordelingen voor verdere evaluatie ^1-6.

Een beperking van microperfusion is dat het alleen in microvasculaire bedden die dun, transparant zijn en voldoende structurele integriteit cannulatie met een glazen micropipet mogelijk kan worden gebruikt. Terwijl de vroege onderzoeken gebruikt kikker bloedvaten in mesenterium en dun cutane pectoris muscle ^7,8, verreweg het meest gebruikte preparaat in zoogdierlijke modellen de ratten mesenterium ^9-15. De meeste onderzoeken hebben zich gericht op acute veranderingen in vasculaire permeabiliteit bestudeerd over een periode van 1-4 uur, maar meer recente onderzoeken zijn uitgebreid tot metingen aan individuele vaartuigen 24-72 uur na een initiële perfusie ^12,16. De recent ontwikkelde CRISPR technologie, die belooft om meer genetisch gemodificeerde rat modellen beschikbaar te stellen voor het bestuderen van de vasculaire permeabiliteit regelgeving ¹⁷ moeten de in deze mededeling beschreven methoden kunnen worden toegepast in venulaire microvaten van het mesenterium in deze belangrijke nieuwe rat modellen.

De werkwijze vereist een omgekeerde microscoop uitgerust met een op maat gebouwde microscooptafel groot genoeg is om zowel de dieren preparaat en ten minste drie micromanipulators gebruikt om positie microtools nabij geperfundeerde vat en een perfusie micropipet passen aan het vat houdenlumen. Bijvoorbeeld een aangepaste platform voor een xy microscoop podium (ongeveer 90 × 60 cm) kunnen worden vervaardigd uit een 1 cm dikke stalen plaat met een rust-proof coating. Het podium is om een ​​technische index tafel of twee dove-tail dia's gemonteerd in een rechte hoek en ondersteund op Teflon pilaren of een bal transfers voor beweging in het horizontale vlak bevestigd. Een typische rig (zie figuur 2) heeft veel gemeen met de microscoop en micropositionering apparatuur die wordt gebruikt voor een reeks van intravitale microcirculatie experimenten zoals die tot enkele bloedvat flow en hematocriet, lokale zuurstof levering van bloed perfusie haarvaten, regulering van de vasculaire gladde meten spierspanning, en de lokale microvasculaire ophoping van fluorescerende tracers geïnjecteerd in de hele omloop. ^18-26

Het fundamentele aspect van de techniek is het meten van de volumestroom (J _v) over een bepaald oppervlak (S) van het microvaatje wand. Volbrengendit via de gemodificeerde Landis techniek hierin beschreven een eenvoudige omgekeerde microscoop voldoende. Een kleine videocamera gemonteerd op de afbeelding poort en het videosignaal, met een toegevoegde tijdbasis, wordt weergegeven op een videomonitor en geregistreerd in digitale vorm op een computer of een digitaal of analoog signaal op een videorecorder. Zodra de canule microvaatje wordt het gedeelte van het microvaatje zichtbaar voor de camera kan worden veranderd door bewegen van de manipulatoren en fase als een eenheid zonder verstoring van de canule.

Meting van transvasculaire stromen kunnen ook worden gecombineerd met uitgebreide onderzoekingen met een gesofisticeerde fluorescentiemicroscoop met geschikte filters zoals installaties voor metingen van opgeloste permeabiliteit, fluorescent verhouding bewaking van cytoplasmatisch calcium of andere cellulaire mechanismen en confocale beeldvorming ^{6,12,13, 27.} Een belangrijk voordeel van microperfusion aanpak is de mogelijkheid om herhaalde metingen maken op hetzelfde vaartuig, Onder gecontroleerde verandering van de drijvende kracht, zoals hydrostatische en oncotische drukken, of geïnduceerde verandering in het vat reacties op ontstekingen. De meest voorkomende ontwerp is een gepaarde vergelijking van gemeten doorlatendheid _(Lp) op hetzelfde vaartuig met het vaartuig eerst geperfuseerd via een micropipet gevuld met een controle perfusaat en de rode celsuspensie een basislijn permeabiliteit staat vast, daarna met een tweede pipet het testmiddel toegevoegd aan het perfusaat. Meerdere canuleringen zijn mogelijk met de cyclus herhaald na reperfusie de controle pipet.

Het onderhavige protocol toont de infusen en microperfusion van een venular vaartuig rat mesenterium water fluxen over het microvaatje wand nemen en te meten het L _p van de vaatwand, een bruikbare index van de permeabiliteit van de gemeenschappelijke route voor water en opgeloste stoffen tussen de intacte endotheliale barrière. De procedure wordt de gewijzigde Landis techniq genoemdUE omdat de oorspronkelijke Landis principe van het gebruik van de relatieve beweging van rode cellen als maat van transvasculaire vloeistofuitwisseling na perfusie geblokkeerd bewaard ^28, maar het aantal experimentele condities (bijvoorbeeld de hydrostatische en albumine oncotische drukverschillen over het microvaatje wand) beschikbaar na microperfusion is veel groter dan in uncannulated bloed perfusie microvaten ^8,29.

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd. 1. Voorafgaande Fabrication van Micropipetten, fixeren en blokkers Trek verscheidene schone borosilicaatglas capillairen doormidden met een elektronische puller ingesteld dat, wanneer teruggetrokken, de gestrekte deel van de buis ongeveer 1 cm in lengte en de twee helften enigszins symmetrisch. Zorg dat de tapsheid in overeenstemming met de afmetinge…

Representative Results

Figuur 4 toont de resultaten van het meten van het tijdsverloop van veranderingen in Lp in een rat venulaire microvaatje achtereenvolgens canule met vier perfusates. 33 De omvang van Lp berekend bij een constante druk werd gebruikt als een maat voor veranderingen in microvaatje permeabiliteit, eerste in de controle staat van een perfusievloeistof met 1% runderserumalbumine toen het vat werd blootgesteld aan het ontstekingsmiddel bradykinine (Bk) met een tweede micropipet…

Discussion

Details van _Lp berekeningen. Hoewel transvasculaire vloeistofbeweging optreedt terwijl het vaartuig vrij geperfundeerd, die uitwisseling veel te klein om te worden gemeten tijdens vrije perfusie omdat het meestal minder dan 0,01% van het vaartuig perfusiesnelheid. Wanneer echter perfusie transiënt wordt gestopt door afsluiten van het microvaatje, transvasculaire stroom (dwz filtratie) wordt gemeten door de beweging van marker rode cellen in het lumen de vloeistofkolom tussen een marker rode…

Materials

MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform–1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio–generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray–needs cord and controller–240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope–see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back–can be purchased from Amazon