L'isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Sommario

Qui, presentiamo una modifica di un metodo precedentemente riportato che consente l'isolamento di mitocondri purificati e di alta qualità da piccole quantità di muscolo scheletrico di topo. Questa procedura si traduce in mitocondri altamente accoppiati che respirano con elevata funzione durante i saggi respirometrici basati su micropiastre.

Abstract

Disfunzionali mitocondri dei muscoli scheletrici hanno un ruolo nel metabolismo alterato osservata con l'invecchiamento, l'obesità e il diabete di tipo II. Saggi respirometrici mitocondriali da isolate preparati mitocondriali consentono la valutazione della funzione mitocondriale, nonché la determinazione del meccanismo (s) d'azione dei farmaci e proteine ​​che modulano il metabolismo. Procedure di isolamento attuali richiedono spesso grandi quantità di tessuto per produrre mitocondri di alta qualità necessari per le analisi respirometrici. I metodi qui presentati descrivono come di alta qualità mitocondri purificato (~ 450 mg) può essere isolato da quantità minime (~ 75-100 mg) di topo muscolo scheletrico per l'uso in misure respiratorie throughput elevato. Abbiamo determinato che il nostro metodo di isolamento si ottiene il 92,5 ± 2,0% mitocondri intatti misurando l'attività citrato sintasi spettrofotometricamente. Inoltre, l'analisi Western Blot in mitocondri isolati portato alla debole espressione del cytosoproteine ​​lic, GAPDH, e il robusto espressione della proteina mitocondriale, COXIV. L'assenza di una banda di GAPDH prominente nei mitocondri isolati è indicativo di poco la contaminazione da fonti non-mitocondriali durante la procedura di isolamento. Soprattutto, la misura di O ₂ tasso di consumo con tecnologia basata micropiastra e determinare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) per saggi respirometrici accoppiati mostra altamente accoppiate (RCR;> 6 per tutti i saggi) e mitocondri funzionali. In conclusione, l'aggiunta di una fase di macinazione separata e riducendo significativamente motorizzato velocità omogeneizzazione di un metodo riportato in precedenza ha permesso l'isolamento di alta qualità e mitocondri purificati da piccole quantità di topo muscoli scheletrici che si traduce nei mitocondri altamente accoppiate che respirano con alta funzione durante micropiastra saggi respirometirc.

Introduzione

La funzione primaria dei mitocondri è quella di produrre ATP dalla fosforilazione ossidativa. Tuttavia, i mitocondri hanno molte altre importanti funzioni cellulari tra cui, ma non solo: la produzione e la detossificazione di specie reattive dell'ossigeno, la regolazione del calcio citoplasmatico e mitocondriale, il traffico degli organelli, l'omeostasi ionica e il coinvolgimento nell'apoptosi^1,2. Pertanto, non sorprende che i mitocondri disfunzionali svolgano un ruolo in molte patologie, come l'invecchiamento, le malattie neurodegenerative, le malattie cardiovascolari, il cancro, l'obesità e il diabete^3,4. È importante sottolineare che i mitocon....

Protocollo

Gli studi su animali sono stati effettuati nel quadro di un protocollo approvato dalla cura degli animali istituzionale e utilizzano Comitato al Virginia Polytechnic Institute e State University.

1. Setup (Tempo: ~ 45 min)

1. Scongelare depositi congelati di 0,25% tripsina, isolamento tampone per mitocondri (IBM) 1 e IBM2 in un bagno d'acqua a 37 ° C.
2. Sciacquare vetreria e strumenti di dissezione in etanolo al 70% e poi con acqua ad elevata purezza.
3. Preparare la soluzione tripsina 0,05% dal 0,25% tripsina magazzino diluendo 1 parte di tripsina in 4 parti IBM1.
4. Mescolare proteasi e fosfatasi inibit....

Risultati

Attività citrato sintasi serve come misura per l'integrità della membrana dal citrato sintasi si trova nella membrana mitocondriale interna, e quindi non dovrebbero essere presenti nelle sospensioni di mitocondri con membrane intatte. La Figura 1 rappresenta l'attività citrato sintasi in campioni non sonicato mitocondriali rispetto sonicato campioni dello stesso isolamento. Sonicating i risultati dei mitocondri in un aumento statisticamente significativo nell'attività citrat.......

Discussione

I metodi qui presentati forniscono una descrizione dettagliata di una procedura di isolamento mitocondriale da quantità minime (~ 75-100 mg) di topo muscoli scheletrici. Questa procedura di isolamento è in grado di produrre ad alto funzionamento, i mitocondri puro (~ 450 mg) come evidenziato da O ₂ tassi di consumo, valori RCR, la massima attività citrato sintasi e di espressione proteica da immunoblotting. È importante sottolineare che i mitocondri isolati da questa procedura può essere utilizzato per più sa.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Essenzialmente grasso	Sigma Aldrich	A6003	N/A
senza acidi- BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/A
KCL	Sigma Aldrich	P9541	N/A
Tris Base	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma Aldrich	E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
Saccarosio	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-Mannitolo	Sigma Aldrich	63559	N/A
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo	Thermo Scientific	25200-056	N/A
Cloruro di sodio cristalli bianchi o polvere cristallina ≥ 99,0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
Sodio dodecil solfato	Sigma Aldrich	L3771	N/A
Desossicolato di sodio	Sigma Aldrich	D6750	N/A
Poliossietilene (12) nonilfenil etere, ramificato	Sigma Aldrich	238651	N / A
Lame di rasoio a taglio singolo	Fisher Scientific	12-640	N / A
Falcon- 100 uM Nylon Filtri cellulari	Fisher Scientific	352360	N / A
Halt Proteasi & Cocktail di inibitori dei fosfati	Thermo Scientific	1861284	N/A
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml con tappo a vite	Thermo Scientific	3474	N/A
Perle di ossido di zirconio	Fisher Scientific	C9012112	N/A
GAPDH (1D4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	N / A
Anti-COXIV anticorpo	Cell Signaling	4844s	Qualsiasi proteina della membrana interna mitocondriale sarà sufficiente
Perossidasi coniugata affinipure Donkey, Anti coniglio IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearh	711-035-152	N / A
Perossidasi coniugato affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearh	115-001-003	N/A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Pierce Kit di analisi delle proteine BCA	Thermo Scientific	23225	N/A
Acido piruvico, 98%	Sigma Aldrich	107360	Conservare a 4 gradi C, pH a 7,4 con KOH prima dell'uso nel saggio respirometrico
Acido succinico	Sigma Aldrich	S9512	Conservare a temperatura ambiente, pH a 7,4 con KOH prima dell'uso nel saggio respirometrico
Acido malico L(-), BioXtra, ≥ 95%	Sigma Aldrich	M6413	Conservare a temperatura ambiente, a 7,4 con KOH prima dell'uso nel saggio respirometrico
Acido L-glutammico	Sigma Aldrich	G1251	Conservare a temperatura ambiente, a 7,4 con KOH prima dell'uso nel saggio respirometrico, a 7,4 con KOH prima dell'uso nel test
Palmitoyl L-carnitina cloruro	Sigma Aldrich	P1645	Conservare a -20 °C
Oligomicina A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Conservare a -20 C
Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)	Sigma Aldrich	C2920	Negozio a 2-8 gradi C
fenilidrazone
≥ 98% (TLC), polvere [FCCP]
Antimicina A da streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Negozio a -20 C
Adenosina 5′-difosfato sale monopotassico disidratato [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Conservare a -20 ° C, a 7,4 con KOH prima dell'uso nel test
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Conservare a temperatura ambiente

respirometrico respirometrico